HEK293 Kit de detección de residuos de ADN en células huésped (3GRAMO)
Resumen de calificación (Cat. Nro.: 4)1331ES60)
- Fondo
Los datos resumidos en este informe fueron realizados por Yeasen Biotechnology para 'HEK293 Kit de detección de residuos de ADN de células huésped (3G) producto. Los datos resumidos son solo para referencia del usuario, y el usuario debe verificar el residuo de la célula huésped. Método de ADN que utiliza sus propias muestras para confirmar que el método puede cumplir con los requisitos del usuario. Se recomienda a todos los laboratorios que utilicen este kit que verifiquen los siguientes parámetros: linealidad, rango, exactitud, precisión, límite de cuantificación, especificidad y robustez.
Yeasen Biotechnology puede proporcionar el informe de calificación detallado para este kit. Si el usuario utiliza este informe, solo se evaluará la idoneidad (que incluye precisión, Exactitud y especificidad) debe verificarse.
- Materiales y métodos experimentales
2.1 HEK293 Kit de detección de residuos de ADN de células huésped (3G), proveedor: Yeasen, n.º de cat.: 41331ES60.
2.2 Kit de preparación de muestras de ADN residual magnético MolPure®, proveedor: Yeasen, n.º de cat.: 18461ES60.
2.3 Datos originales: la versión electrónica fue registrada en el 'Informe Experimental' el subarchivo del archivo padre 'HEK293 Kit de detección de residuos de ADN en células huésped (3G)'.
2.4 Métodos: Los materiales y métodos de operación utilizados para el experimento fueron básicamente producidos o establecidos por Yeasen Biotechnology, los cuales fueron evaluados y verificados durante mucho tiempo, el desarrollo y fabricación del kit siguieron el sistema ISO 13485.
- Contenidos y resultados de la calificación
3.1 Rango de detección
El rango lineal del kit fue de 30 fg/μL ~ 300 pg/μL con R2≥0,998 y la eficiencia de amplificación fue del 90%~110% con CV<15% para cada ensayo de concentración.
Figura 1 Curva estándar de qPCR de ADN HEK293 (3G)
3.2 Precisión
3.2.1 Rrecuperación ecológica
3.2.1.1 Experimento de recuperación de adición de muestra en blanco
Muestras de HEK293 Se prepararon estándares de ADN en concentraciones altas y bajas: 300 pg/μL, 3 pg/μL y 30 fg/μL, respectivamente, y se analizaron después de la extracción utilizando el kit de pretratamiento de muestras de ADN residual con método de perlas magnéticas (se realizaron 2 réplicas de extracción para cada muestra y 3 réplicas de ensayo para cada extracción), y se analizaron las recuperaciones de muestras y los CV.
Para diferentes concentraciones de muestras de ADN, las recuperaciones variaron entre el 70% y el 130%, y los CV fueron todos <20%.
| Tipo de muestra | Concentración teórica | Extracto 1 media | Extracto 2 media | Concentración media | CV | Recuperación |
| Muestra en blanco | / | / | / | / | / | / |
| Muestra de recuperación 1 | 300 pg/μL | 306.81 pg/μL | 279,57 pg/μL | 293,82 pg/μL | 6,56% | 97,94% |
| Muestra de recuperación 2 | 3 pg/μL | 3.11 pg/μL | 2,99 pg/μL | 3.09 pg/μL | 2,75% | 103,00% |
| Muestra de recuperación 3 | 30 fg/μl | 31.02 fg/μL | 30,63 fg/μL | 30,83 fg/μL | 0,89% | 102,77% |
Tabla 1 Recuperación de la adición de muestra en blanco
3.2.1.2 Experimento de recuperación de adición de muestra simulada
Se extrajeron muestras de la misma concentración (3 pg/μL de ADN HEK293) (se realizaron 2 réplicas de extracción para cada muestra y 3 réplicas de ensayo para cada extracción) con 5 soluciones de fondo diferentes (alto contenido de proteínas, alto contenido de ácido nucleico, pH alto y bajo, alto contenido de sal) y se analizaron las recuperaciones de muestras y los CV.
Las recuperaciones de muestras de ADN para diferentes soluciones de fondo variaron entre el 70% y el 130%, con todos los CV <20%.
| Tipo de muestra | Concentración teórica | Extracto 1 media | Extracto 2 media | Concentración media | CV | Recuperación |
| Muestra básica | / | / | / | / | / | / |
| Alto contenido de proteínas | 3 pg/μL | 2.65 | 2.80 | 2.73 | 3,80% | 90,87% |
| Alto nivel de ácido nuclear | 2.82 | 2,97 | 2,90 | 3,71% | 96,58% | |
| Alto contenido de sal | 2.88 | 2.70 | 2,79 | 4,47% | 92,89% | |
| pH alto | 2.81 | 2.93 | 2.87 | 2,98% | 95,71% | |
| pH bajo | 2.76 | 2,79 | 2,77 | 0,99% | 92,48% |
Tabla 2 Recuperación básica de la adición de muestras
3.3 Precisión
3.3.1 Repetibilidad
Repita el ensayo 10 veces para los estándares de ADN HEK293 a una concentración de 30 fg/μL con un CV <15%.
| Repeticiones | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | Significar | % de CV |
| Valor de detección (fg/μL) | 29,51 | 30.02 | 30.13 | 30.16 | 27,99 | 31.01 | 31.05 | 30,95 | 31.02 | 29,86 | 30.17 | 3,15% |
Tabla 3 Resultados de repetibilidad
3.3.2 Precisión intermedia
Tres experimentadores probaron de forma independiente muestras estándar de ADN HEK293 en concentraciones altas y bajas: 300 pg/μL, 3 pg/μL y 30 fg/μL, y se realizaron tres réplicas para cada concentración, y los CV de los nueve datos obtenidos fueron <15%.
| Exp |
Concentración real Concentración teórica | ADN HEK293 (3G) | ||
| 300 pg/ul | 3 pg/ul | 30 fg/ul | ||
| Experiencia 1 | Determinación 1 | 319,58 | 3.026 | 32.02 |
| Determinación 2 | 309,76 | 3.051 | 37.01 | |
| Determinación 3 | 309,24 | 3.067 | 36.03 | |
| Exp. 2 | Determinación 4 | 308.34 | 2.909 | 29,91 |
| Determinación 5 | 308,54 | 2.9 | 29,67 | |
| Determinación 6 | 305,83 | 2.921 | 28.85 | |
| Exp. 3 | Determinación 7 | 299.11 | 3.035 | 29.36 |
| Determinación 8 | 300.07 | 2.833 | 31.14 | |
| Determinación 9 | 302.03 | 3.033 | 33.07 | |
| / | Significar | 306,95 | 2.975 | 31,90 |
| / | % de CV | 2,03% | 2,83% | 9,26% |
Tabla 4 Resultados de precisión intermedia
3.4 Especificidad
Se evaluó la interferencia del ADN genómico celular comúnmente utilizado en la producción de productos biológicos con reactivos de detección de ADN HEK293, y el grupo de interferencia se superpuso con el grupo de control y no se observó interferencia (la figura a continuación muestra, en orden, los datos de interferencia del ADN genómico de CHO, E. coli y Pichia Pastoris con reactivos de detección de ADN HEK293).
Figura 2 Resultados del experimento de interferencia
3.5 Límite de cuantificación
Se detectó ADN HEK293 a 30 fg/μL, 20 fg/μL, 10 fg/μL y 5 fg/μL, con 10 réplicas para cada concentración. Los resultados mostraron que el CV fue <20% a concentraciones de 10 fg/μL y superiores. Es decir, el límite de cuantificación del kit de detección de residuos de ADN de células huésped HEK293 (3G) fue de 10 fg/μL.
|
Repeticiones Elemento de prueba | ADN HEK293 (3G) (fg/μL) | |
| Cantidad | Porcentaje de recálculo | |
| 1 | 11.04 | 110,40% |
| 2 | 9,97 | 99,70% |
| 3 | 11.12 | 111,20% |
| 4 | 11.07 | 110,70% |
| 5 | 11.21 | 112,10% |
| 6 | 9,93 | 99,30% |
| 7 | 10.25 | 102,50% |
| 8 | 10.16 | 101,60% |
| 9 | 10.08 | 100,80% |
| 10 | 10.11 | 101,10% |
| Significar | 10.49 | / |
| % de CV | 5,14% | / |
Figura 3 Resultado de la prueba qPCR de ADN HEK293 (3G) de 10 fg/μL
3.6 Robustez
Este kit ha sido probado y es adecuado, entre otros, para los siguientes instrumentos:
| Proveedor | Modelos de instrumentos | Eficiencias de amplificación | R2 | Límite de cuantificación (fg/μL) | % de CV |
| Termo | ABI 7500 | 102,84% | 1 | 10 | 7% |
| Termo | Estudio cuantitativo ABI5 | 104,70% | 0,999 | 10 | 9% |
| Hongos de Shanghái | SLAN | 101,46% | 0,999 | 10 | 8% |
Tabla 5 Resultados de la prueba de idoneidad del instrumento
3.7 Estabilidad
3.7.1 Estabilidad a la congelación y descongelación
El kit de detección de residuos de ADN de células huésped HEK293 (3G) se probó mediante congelación y descongelación repetidas 10 veces y el rendimiento del kit no se vio afectado.
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Indicadores de prueba Tiempos de congelación y descongelación | Parámetro | Tiempo T0 | Congelar y descongelar 10 veces |
| Parámetro de curva estándar | Eficiencias de amplificación | 99,34% | 100,78% |
| R2 | 1 | 1 | |
| Límite de cuantificación (30 fg/μL) | CV | 11% | 7% |
Tabla 6 Análisis de los resultados de estabilidad de congelación y descongelación
3.7.2 Estabilidad acelerada
El kit de detección de residuos de ADN de células huésped HEK293 (3G) se almacenó a una temperatura de entre 2 y 8 °C durante 30 días y a 37 °C durante 14 días, respectivamente. El rendimiento del kit no se vio afectado.
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Indicadores de prueba Temperatura y tiempo de aceleración | Parámetro | Tiempo T0 | 37℃ 7 días | 37℃ 14 días |
| Parámetro de curva estándar | Eficiencias de amplificación | 103,83% | 101,58% | 100,47% |
| R2 | 0,999 | 1 | 1 | |
| Límite de cuantificación (30 fg/μL) | % de CV | 8% | 5% | 5% |
Tabla 7 Análisis de resultados de estabilidad acelerada
3.8 Límite de espacio en blanco
El control sin plantilla (NTC) fue una dilución de plantilla con 96 repeticiones de valores de CT >32 (más la línea de umbral de calibración ROX establecida en 0,06).
Figura 4 Resultados del experimento NTC
- 4.Referencia
4.1 Comisión de la Farmacopea China (ChPC). Farmacopea de la República Popular China (Vol. III) [S]. Pekín: China Medical Science and Technology Press, págs. 542-543, 2020.
4.2 NMPA, 2007: Principios generales para la revisión técnica de la validación de métodos analíticos para el control de calidad de productos biológicos.
4.3 ICH(2022)《Validación de métodos analíticos Q2》, versión borrador.
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