E. coli Kit de detección de residuos de ADN en células huésped (2G)
Resumen de calificación (Cat. Nro.: 4)1308ES60)
- Fondo
Los datos resumidos en este informe fueron elaborados por Yeasen Biotechnology para el producto 'Kit de detección de residuos de ADN de células hospedadoras de E. coli (2G)'. Los datos resumidos son solo para referencia del usuario, y el usuario debe verificar los residuos de células hospedadoras. Método de ADN que utiliza sus propias muestras para confirmar que el método puede cumplir con los requisitos del usuario. Se recomienda a todos los laboratorios que utilicen este kit que verifiquen los siguientes parámetros: linealidad, rango, exactitud, precisión, límite de cuantificación, especificidad y robustez.
Yeasen Biotechnology puede proporcionar el informe de calificación detallado para este kit. Si el usuario utiliza este informe, solo se evaluará la idoneidad (que incluye precisión, Exactitud y especificidad) debe verificarse.
- Materiales y métodos experimentales
2.1 Kit de detección de residuos de ADN de células huésped de E. coli (2G), proveedor: Yeasen, n.º de cat.: 41308ES60.
2.2 Kit de preparación de muestras de ADN residual magnético MolPure®, proveedor: Yeasen, n.º de cat.: 18461ES60.
2.3 Estándar nacional para el contenido de ADN de E. coli: Cat. 270027, Lote No.: 201101, concentración: 96,2 μg/mL, condición de almacenamiento: -70℃, adquirido en: Institutos Nacionales para el Control de Alimentos y Medicamentos.
2.4 Datos originales: la versión electrónica fue registrada en el 'Informe Experimental' el subarchivo del archivo padre 'Kit de detección de residuos de ADN de células huésped de E. coli (2G)'.
2.5 Métodos: Los materiales y métodos de operación utilizados para el experimento fueron básicamente producidos o establecidos por Yeasen Biotechnology, los cuales fueron evaluados y verificados durante mucho tiempo, el desarrollo y fabricación del kit siguieron el sistema ISO 13485.
- Contenidos y resultados de la calificación
3.1 Rango de detección
El rango lineal del kit fue de 30 fg/μL ~ 300 pg/μL con R2=1, y la eficiencia de amplificación fue del 101,74% con CV<15% para cada ensayo de concentración.
Figura 1 Curva estándar de qPCR de ADN de E. coli (2G)
3.2 Precisión
3.2.1 Desviación de Norma nacional para el contenido de ADN de E. coli
El material de referencia de ADN de E. coli en cada lote del kit se calibró utilizando el estándar nacional para el contenido de ADN de E. coli. El material de referencia de ADN de Yeasen estaba básicamente libre de desviaciones del estándar nacional para el contenido de ADN de E. coli. curva de calibración y la desviación del valor del ensayo fue <5%.
3.2.2 Rrecuperación ecológica
3.2.2.1 Experimento de recuperación de adición de muestra en blanco
Se prepararon muestras de estándares de ADN de E. coli en concentraciones altas y bajas: 300 pg/μL, 3 pg/μL y 30 fg/μL, respectivamente, y se analizaron después de la extracción utilizando el kit de pretratamiento de muestras de ADN residual con método de perlas magnéticas (se realizaron 2 réplicas de extracción para cada muestra y 3 réplicas de ensayo para cada extracción), y se analizaron las recuperaciones de muestras y los CV.
Para diferentes concentraciones de muestras de ADN, las recuperaciones variaron entre el 70% y el 130%, y los CV fueron todos <20%.
| Tipo de muestra | Concentración teórica | Extracto 1 media | Extracto 2 media | Concentración media | CV | Recuperación |
| Muestra en blanco | / | / | / | / | / | / |
| Muestra de recuperación 1 | 300 pg/μL | 250,56 pg/μL | 262.11 pg/μL | 256.33 pg/μL | 4,41% | 85,44% |
| Muestra de recuperación 2 | 3 pg/μL | 2.29 pg/μL | 2.56 pg/μL | 2.42 pg/μL | 7,09% | 80,77% |
| Muestra de recuperación 3 | 30 fg/μl | 33,62 fg/μL | 32.61 fg/μL | 33.12 fg/μL | 14,28% | 110,39% |
Tabla 1 Recuperación de la adición de muestra en blanco
3.2.2.2 Experimento de recuperación de adición de muestra simulada
Se extrajeron muestras de la misma concentración (3 pg/μL de ADN de E. coli) (se realizaron 2 réplicas de extracción para cada muestra y 3 réplicas de ensayo para cada extracción) con 5 soluciones de fondo diferentes (alto contenido de proteínas, alto contenido de ácido nucleico, pH alto y bajo, alto contenido de sal) y se analizaron las recuperaciones de muestras y los CV.
Las recuperaciones de muestras de ADN para diferentes soluciones de fondo variaron entre el 70% y el 130%, con todos los CV <20%.
| Tipo de muestra | Concentración teórica | Extracto 1 media | Extracto 2 media | Concentración media | CV | Recuperación |
| Muestra básica | / | / | / | / | / | / |
| Alto contenido de proteínas | 3 pg/μL | 2.25 | 2.23 | 2.24 | 1,09% | 74,74% |
| Alto nivel de ácido nuclear | 3.93 | 3,96 | 3,95 | 1,56% | 131,52% | |
| Alto contenido de sal | 2.69 | 2.67 | 2.68 | 2.63 | 89,20% | |
| pH alto | 2,90 | 3.67 | 3.29 | 13,82% | 109,55% | |
| pH bajo | 2,77 | 2.87 | 2.82 | 3,41% | 94,01% |
Tabla 2 Recuperación básica de la adición de muestras
3.3 Precisión
3.3.1 Repetibilidad
Repita el ensayo 10 veces para los estándares de ADN de E. coli a una concentración de 3 pg/μL con un CV <15%.
| Repeticiones | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | Significar | CV |
| Valor de detección (fg/μL) | 3.16 | 2.87 | 2,97 | 2.86 | 2.81 | 2,97 | 3.14 | 3.21 | 3.14 | 3.1 | 3.02 | 4,78% |
Tabla 3 Resultados de repetibilidad
3.3.2 Precisión intermedia
Tres experimentadores probaron de forma independiente muestras estándar de ADN de E. coli en concentraciones altas y bajas: 300 pg/μL, 3 pg/μL y 30 fg/μL, y se realizaron tres réplicas para cada concentración, y los CV de los nueve datos obtenidos fueron <15%.
| Exp |
Concentración real Concentración teórica | ADN de E. coli (2G) | ||
| 300 pg/ul | 3 pg/ul | 30 fg/ul | ||
| Experiencia 1 | Determinación 1 | 295,65 | 3.22 | 26,90 |
| Determinación 2 | 287,71 | 3.24 | 32.00 | |
| Determinación 3 | 300.23 | 3.17 | 27,50 | |
| Exp. 2 | Determinación 4 | 306.06 | 3.13 | 37.30 |
| Determinación 5 | 299,76 | 3.02 | 32,70 | |
| Determinación 6 | 299.63 | 3.02 | 34.00 | |
| Exp. 3 | Determinación 7 | 266,70 | 3.01 | 35,90 |
| Determinación 8 | 272,89 | 3.09 | 40,70 | |
| Determinación 9 | 276,51 | 3.01 | 35,20 | |
| / | Significar | 289,46 | 3.10 | 33,60 |
| / | CV | 4,89% | 3,02% | 13,18% |
Tabla 4 Resultados de precisión intermedia
3.4 Especificidad
Se evaluó la interferencia del ADN genómico celular comúnmente utilizado en la producción de productos biológicos con reactivos de detección de ADN de E. coli, y el grupo de interferencia se superpuso con el grupo de control y no se observó interferencia (la figura a continuación muestra, en orden, los datos de interferencia del ADN genómico HEK293, Vero y CHO con reactivos de detección de ADN de E. coli).
Figura 2 Resultados del experimento de interferencia
3.5 Límite de cuantificación
Se detectó ADN de E. coli a 50 fg/μL, 40 fg/μL, 30 fg/μL, 10 fg/μL y 5 fg/μL, con 10 réplicas para cada concentración. Los resultados mostraron que el CV fue <20% en concentraciones de 30 fg/μL y superiores. Es decir, el límite de cuantificación del kit de detección de residuos de ADN de células huésped de E. coli (2G) fue de 30 fg/μL.
|
Repeticiones Elemento de prueba | ADN de E. coli (2G) (fg/μL) | |
| Cantidad | Ratio de recálculo | |
| 1 | 29.43 | 98,09% |
| 2 | 29,51 | 98,35% |
| 3 | 32.04 | 106,79% |
| 4 | 26.07 | 86,89% |
| 5 | 34.06 | 113,53% |
| 6 | 33,54 | 111,79% |
| 7 | 26,95 | 89,82% |
| 8 | 27.38 | 91,26% |
| 9 | 27.04 | 90,13% |
| 10 | 26.10 | 87,02% |
| Significar | 29.21 | / |
| CV | 10,40% | / |
Figura 3 Resultado de la prueba qPCR de ADN de E. coli (2G) de 30 fg/μL
3.6 Robustez
Este kit ha sido probado y es adecuado, entre otros, para los siguientes instrumentos:
| Proveedor | Modelos de instrumentos | Eficiencias de amplificación | R2 | Límite de cuantificación (fg/μL) | CV |
| Termo | ABI 7500 | 101,74% | 1 | 30 | 13,30% |
| Termo | Estudio cuantitativo ABI5 | 100,46% | 1 | 30 | 12,40% |
| Bio-Rad | CFX96 | 99,20% | 0,999 | 30 | 13,76% |
| Hongos de Shanghái | SLAN | 100,40% | 0,999 | 30 | 11,67% |
Tabla 5 Resultados de la prueba de idoneidad del instrumento
3.7 Estabilidad
3.7.1 Estabilidad a la congelación y descongelación
El kit de detección de residuos de ADN de células huésped de E. coli (2G) se probó mediante congelación y descongelación repetidas 10 veces y el rendimiento del kit no se vio afectado.
|
Indicadores de prueba Tiempos de congelación y descongelación | Parámetro | Tiempo T0 | Congelar y descongelar 10 veces |
| Parámetro de curva estándar | Eficiencias de amplificación | 98,23% | 100,20% |
| R2 | 1 | 0,999 | |
| Límite de cuantificación (30 fg/μL) | CV | 15,07% | 9,66% |
Tabla 6 Análisis de los resultados de estabilidad de congelación y descongelación
3.7.2 Estabilidad acelerada
MI.El kit de detección de residuos de ADN de células hospedadoras de E. coli (2G) se almacenó a una temperatura de entre 2 y 8 °C durante 30 días y a 37 °C durante 14 días, respectivamente. El rendimiento del kit no se vio afectado.
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Indicadores de prueba Temperatura y tiempo de aceleración | Parámetro | Experimento 1 | Experimento 2 | ||
| Tiempo T0 | 2~8℃ 30 Días | Tiempo T0 | 37℃ 14 días | ||
| Parámetro de curva estándar | Eficiencias de amplificación | 97,77% | 99,81% | 98,39% | 98,65% |
| R2 | 1 | 1 | 1 | 1 | |
| Límite de cuantificación (30 fg/μL) | CV | 11,04% | 13,79% | 9,55% | 14,55% |
Tabla 7 Análisis de resultados de estabilidad acelerada
- 4.Referencia
4.1 Comisión de la Farmacopea China (ChPC). Farmacopea de la República Popular China (Vol. III) [S]. Pekín: China Medical Science and Technology Press, págs. 542-543, 2020.
4.2 NMPA, 2007: Principios generales para la revisión técnica de la validación de métodos analíticos para el control de calidad de productos biológicos.
4.3 ICH(2022)《Validación de métodos analíticos Q2》, versión borrador.
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