En los últimos años, con el rápido desarrollo de la biomedicina, la aparición de terapias celulares y genéticas en el marco de la pandemia de COVID-19 y la llegada de las vacunas de ARNm, garantizar la seguridad y la fiabilidad de los productos biológicos se ha convertido en un punto de atención prioritario para los gobiernos y los organismos reguladores de todo el mundo. La contaminación por micoplasma es un tipo de contaminación común, pero normalmente difícil de eliminar. Los requisitos reglamentarios exigen "garantizar la ausencia de contaminación por micoplasma" en los bioprocesos que implican el cultivo de células.
Requisitos de las agencias reguladoras para las pruebas de micoplasma:
- La "Guía para la industria: caracterización y calificación de sustratos celulares y otros materiales biológicos utilizados en la producción de vacunas virales para indicaciones de enfermedades infecciosas" de la FDA estipula el control de micoplasma para materias primas, semillas virales y fluidos de cosecha sin procesar.
- La edición 2020 de la Parte III de la Farmacopea China "Preparación y control de calidad de sustratos de células animales utilizados para pruebas de producción de productos biológicos" requiere pruebas de micoplasma para células de producción, incluidos los bancos de células maestros (MCB), los bancos de células de trabajo (WCB) y las células de final de producción (EOPC).
- Las "Directrices técnicas para la investigación farmacéutica y la evaluación de productos de terapia celular inmunitaria (ensayo)" recomiendan realizar pruebas relacionadas con la seguridad del micoplasma en muestras intermedias adecuadas en momentos clave o implementar medidas pertinentes para el control. Las pruebas de micoplasma también son necesarias como prueba de liberación de productos finales.
Pruebas de ácidos nucleicos (NAT) y métodos tradicionales:
Antes de la aparición de métodos de detección rápida como la tecnología de amplificación de ácidos nucleicos (NAT), se empleaban métodos de cultivo tradicionales y ensayos de células indicadoras. Sin embargo, debido a los largos ciclos de detección o a problemas de sensibilidad, estos métodos a menudo prolongaban los ciclos de producción o liberación o requerían la liberación condicional de materiales celulares en función de la evaluación de riesgos o la exploración de métodos alternativos. Con el avance de las terapias celulares y genéticas, existe una creciente demanda dentro de la industria de métodos de detección de micoplasma con mayor puntualidad y sensibilidad. La corta vida útil de los productos no puede soportar largos períodos de prueba, por lo que los métodos NAT han surgido como alternativas favorables.
En la actualidad, la Farmacopea Europea (EP) <2.6.7>, la Farmacopea Japonesa (JP) y la Farmacopea de los Estados Unidos (USP) <63> han incluido los métodos NAT como métodos de detección de micoplasma. Sin embargo, la validación de este método y la comparación con los métodos tradicionales para garantizar que su sensibilidad no sea inferior son requisitos previos para su uso. Aunque la edición de 2020 de la Farmacopea China (ChP) no ha incluido la NAT como método de detección de micoplasma, menciona la posibilidad de utilizar "otros métodos reconocidos por la autoridad reguladora nacional de medicamentos". En mayo de 2022, el Centro de Revisión de Medicamentos de la Administración Nacional de Productos Médicos (NMPA) publicó las "Directrices técnicas para la investigación farmacéutica y la evaluación de productos de terapia celular inmunitaria (ensayo)", que sugieren considerar el desarrollo de nuevos métodos de detección estéril y de micoplasma para pruebas de liberación en circunstancias especiales cuando el volumen de muestra es limitado o se necesita una liberación rápida y los métodos farmacopéicos son inadecuados. Por lo tanto, se espera que los métodos NAT sean cada vez más utilizados por más proveedores de materias primas y empresas de productos medicinales de terapia avanzada (ATMP) como un método capaz de respaldar las pruebas de liberación rápida de micoplasma.
Método NAT - Requisitos de validación del método
El proceso de validación de los métodos NAT se describe detalladamente en la Farmacopea Europea <2.6.7> y la Farmacopea Japonesa, con un contenido esencialmente consistente. Los Institutos Nacionales para el Control de Alimentos y Medicamentos (NIFDC) también han publicado un artículo titulado "Consideraciones sobre los métodos de detección de ácidos nucleicos y la validación metodológica para el examen de micoplasma", con el objetivo de proporcionar orientación para los desarrolladores y usuarios de métodos de amplificación de ácidos nucleicos de micoplasma en China. La especificidad, el límite de detección y la robustez son esenciales para validar los métodos de amplificación de ácidos nucleicos de micoplasma. Si se utilizan kits comerciales para la detección de micoplasma, la validación de la idoneidad del método se puede realizar en función del informe completo de rendimiento del kit del proveedor, combinado con el entorno del laboratorio y el tipo de muestra.
Especificidad:
La especificidad se refiere a la capacidad de un método analítico para determinar con precisión el analito en presencia de otros componentes (como impurezas, productos de degradación, excipientes, etc.). El PE enfatiza la necesidad de centrarse en las reacciones cruzadas entre otras especies bacterianas estrechamente relacionadas con el árbol filogenético, como Clostridium, Lactobacillus y Streptococcus dentro de las bacterias Gram-positivas. También se debe prestar atención a los tipos de contaminantes comunes, como la contaminación con ADN humano en células huésped y entornos experimentales.
Límite de detección:
El límite de detección es la cantidad mínima de analito que se puede detectar en una muestra. Sirve como base de identificación cualitativa y no necesita cuantificarse como un valor exacto. El EP requiere 24 puntos de datos de detección para cada especie de micoplasma en cada concentración de dilución. Esto se puede lograr realizando tres diluciones seriadas de 10 veces independientes en días diferentes, con ocho detecciones repetidas para cada gradiente de dilución, o realizando cuatro diluciones seriadas de 10 veces independientes en días diferentes, con seis detecciones repetidas para cada gradiente de dilución. Una tasa de positividad de detección superior al 95% puede considerarse como el límite de detección. Para los tipos de micoplasma que requieren confirmación del límite de detección, los fabricantes de kits deben cubrir tantos tipos de micoplasma como sea posible según lo exijan las farmacopeas regulatorias y explorar los límites de detección para cada tipo de micoplasma. Para las compañías biofarmacéuticas, es recomendable considerar también los tipos de micoplasma humano.
- Si se utilizan o encuentran células o materiales aviares durante el proceso de producción, se debe realizar la verificación del límite de detección de Mycoplasma synoviae.
- Si durante el proceso de producción se utilizan o se encuentran materiales de insectos o plantas, se debe realizar la verificación del límite de detección de Acholeplasma.
- El micoplasma nasal porcino tiene una alta prevalencia en muestras contaminadas con micoplasma y ha atraído la atención del Instituto de Control de Alimentos y Medicamentos de China.
En comparación con la Farmacopea Europea, la Farmacopea Japonesa no menciona el micoplasma aviar para el cual se requiere la verificación del límite de detección, pero incluye el micoplasma salival.
Robustez:
La robustez se refiere a la capacidad de un método de soportar pequeñas variaciones en las condiciones de medición sin verse afectado, lo que proporciona una base para el uso del método establecido en pruebas de rutina. La evaluación de la robustez debe centrarse en la tolerancia de los métodos de detección de micoplasma a las variaciones en la concentración de MgCl2, cebadores y dNTP en los reactivos de detección, los cambios en los kits de extracción de ácidos nucleicos o los pasos de extracción y el uso de diferentes amplificadores de ácidos nucleicos.
Estudio de comparabilidad
Si se va a utilizar NAT como sustituto de los métodos farmacopéicos, es necesario confirmar mediante comparación que NAT puede reemplazar a los métodos basados en cultivo o a los métodos de cultivo de células indicadoras.Esto generalmente implica considerar el límite de detección del método, así como la especificidad (como el rango de cobertura de micoplasma y los posibles falsos positivos). Para comparar los límites de detección, se debe cumplir con el criterio de que "un límite de detección de 10 UFC/ml puede reemplazar los métodos basados en cultivos, y un límite de detección de 100 UFC/ml puede reemplazar los métodos de cultivo de células indicadoras".
Hay dos enfoques opcionales para realizar estudios de comparabilidad:
- Realizar experimentos sincrónicos utilizando las mismas cepas de micoplasma validadas para los métodos NAT y farmacopéicos para confirmar el límite de detección.
- Comparar los resultados de la validación NAT con los resultados de validación de métodos farmacopeicos anteriores, pero se requiere una documentación cuidadosa de los archivos de confirmación de los estándares de micoplasma utilizados en ambos métodos.
Detección de Mycoplasma mediante qPCR NAT: una solución integral
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El kit de prueba de PCR cuantitativa para micoplasma MycAway™ de Yeasen (método de sonda) es un producto de detección cualitativa rápida basado en NAT (técnicas de amplificación de ácidos nucleicos) para detectar una posible contaminación por micoplasma en materias primas, bancos de células, semillas virales, fluidos de recolección de virus o células y células terapéuticas. Este kit, basado en tecnología de PCR cuantitativa, utiliza sondas de fluorescencia Taqman para detectar cualitativamente el ADN de micoplasma en la muestra de prueba, cubriendo más de 160 secuencias de ADN de micoplasma. Sigue estrictamente las pautas y requisitos de EP 2.6.7 y JP G3 para la detección de micoplasma, demostrando alta sensibilidad, buena especificidad y seguridad. Se puede utilizar junto con el kit de pretratamiento de muestras de ADN residual con perlas magnéticas MolPure® para extraer muestras manualmente o extraer automáticamente ácidos nucleicos utilizando el extractor de ácidos nucleicos completamente automático Auto-Pure 32A. Después del pretratamiento de la muestra para eliminar las impurezas que interfieren y obtener ADN de micoplasma purificado, se recoge la señal de fluorescencia de la sonda mediante qPCR para determinar el resultado de la detección.
Servicios técnicos
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| Descripción | Número de pieza |
| Kit de preparación de muestras de ADN residual magnético MolPure® | 18461ES |
| Kit de detección de qPCR de micoplasma MycAway™ (2G) | 40619ES |