A medida que la investigación médica continúa avanzando, la terapia dirigida ha adquirido mayor madurez. La premisa del tratamiento dirigido es realizar pruebas genéticas en las dianas moleculares de los medicamentos para identificar mutaciones genéticas que causan trastornos hereditarios o neoplasias malignas. ARMS-PCR es un método novedoso basado en PCR que puede detectar numerosas mutaciones puntuales del ADN. Actualmente, es uno de los métodos más esenciales y extendidos para la identificación genética personalizada de cánceres. Los beneficios de su uso terapéutico han sido ampliamente reconocidos por los expertos en el campo.

1. ¿Cómo funciona la PCR específica de alelos?
2. ¿Cómo mejorar la especificidad de ARMS?
3. ¿Cuáles son las características de los productos ofrecidos por Yeasen?
4. ¿Qué son los datos de rendimiento del producto?
5. ¿Cómo la gente pide productos?

1. ¿Cómo funciona la PCR específica de alelos?

ARMS-PCR es el sistema de amplificación de mutaciones refractarias (ARMS-PCR), también conocido como PCR específica de alelos (AS-PCR). La extensión específica de alelos se regula para identificar el alelo de tipo salvaje y el gen de tipo salvaje mutante, y el valor de la señal de fluorescencia se mide utilizando la técnica de sonda Taqman.
Los cebadores de PCR ARMS están diseñados con diferentes nucleótidos en el extremo 3' de los dos cebadores anteriores del alelo, y los dos cebadores son, respectivamente, específicos para el tipo salvaje y el tipo mutante. Durante la amplificación, los cebadores anteriores que no coinciden completamente con el molde no pueden formar pares de bases complementarios, lo que da como resultado desajustes, extensión impedida e incapacidad para generar productos de PCR, mientras que los sistemas de cebadores que coinciden con el molde pueden amplificar los productos de PCR correspondientes. El fluoróforo de la sonda Taqman puede emitir una señal fluorescente que puede ser detectada por el dispositivo, y el genotipo puede validarse evaluando los datos de fluorescencia.
La tecnología ARMS tiene una alta sensibilidad, el límite de detección puede alcanzar 100 copias/mL y el límite de detección para tejido tumoral puede alcanzar una tasa de mutación del 0,5%. Además, ARMS requiere mucho tiempo y es de bajo costo, y los resultados son intuitivos y fáciles de juzgar. Esto se debe a que ARMS combinado con qPCR o tecnología de electroforesis requiere solo una reacción de PCR, que lleva menos tiempo. Solo es necesario optimizar los cebadores anteriores para la tecnología ARMS, que tiene un costo menor y resultados intuitivos en comparación con la tecnología de PCR en tiempo real que utiliza sondas MGB. Dado que la mayor parte del ADN extraído de muestras de tejido embebidas en parafina está fragmentado, no se pueden obtener resultados de detección precisos. El método ARMS está diseñado para minimizar la longitud del producto objetivo, abordando así esta dificultad en el tejido embebido en parafina. Al mismo tiempo, ARMS combinado con la plataforma PCR realiza una operación de tubo cerrado, que es simple de operar y no requiere posprocesamiento del producto, evitando así la contaminación de los productos de amplificación en la mayor medida posible.
En teoría, la ADN polimerasa Taq debe ser completamente complementaria a la plantilla restante en el extremo 3' del cebador para llevar a cabo una polimerización eficiente. Sin embargo, la rigurosidad de la ADN Taq se ve afectada por varios factores. En algunos casos, una extensión puede proceder incluso si la base terminal 3' del cebador no es complementaria a la plantilla. Si solo hay un desajuste de bases en el extremo 3', los cebadores pueden desajusterse y extenderse, pero la eficiencia de extensión es baja. Diferentes dislocaciones del extremo 3' tienen diferentes eficiencias de extensión. Si se introducen otras bases desajustes en el extremo 3', el número de desajustes es demasiado grande y el extremo 3' no se puede extender más allá de un cierto nivel.Por lo tanto, una sola falta de coincidencia de bases en el extremo 3' del cebador no puede distinguir adecuadamente los dos alelos, lo que produce resultados falsos positivos.

2. ¿Cómo mejorar la especificidad de ARMS?

El objetivo de mejorar la especificidad de ARMS es mejorar la especificidad de la extensión del cebador. Se puede introducir una base no coincidente en la segunda o tercera base desde el extremo 3'. Las bases no coincidentes actúan junto con las bases no coincidentes en el extremo 3' y, en la plantilla que no es complementaria al extremo 3', se reduce la tasa de productos de amplificación del cebador. Si bien los cebadores amplifican normalmente en plantillas complementarias a sus extremos 3', el tipo de bases no coincidentes de los cebadores depende del tipo de desajuste de bases en el extremo 3'.
Una vez diseñados los cebadores específicos para ARMS, se requiere un par de sondas TaqMan para la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia específica de alelos. Las sondas TaqMan tienen dos colorantes fluorescentes, el extremo 5' es un gen fluorescente y el extremo 3' tiene un gen de extinción de fluorescencia general. En una sonda completa, el gen extintor y el gen fluorogénico están espacialmente muy cerca, lo que da como resultado la extinción de la fluorescencia. En circunstancias normales, no se puede detectar la fluorescencia emitida por el fluoróforo en el extremo 5', y solo se puede detectar la fluorescencia de fondo del extintor en el extremo 3'. En el proceso de amplificación del gen diana, tanto los cebadores de PCR como las sondas marcadas con fluorescencia serán complementarios a la secuencia diana durante la des-OR. Cuando la enzima Taq encuentra una sonda unida de forma estable a la plantilla al extender la cadena de la plantilla, la exonucleasa 5'-3' de la enzima Taq degradará la sonda específica unida a la plantilla. El fluoróforo de la sonda se separa por un espacio físico, el efecto de extinción desaparece y se emite fluorescencia. Los desajustes entre las sondas débilmente fluorescentes y las secuencias objetivo reducirán la cantidad de fluorescencia liberada.

Figura 1 Concepto fundamental de ARMS-PCR

3. ¿Cuáles son las características de los productos ofrecidos por Yeasen?

YEASEN Hieff Unicon™ Multiplex ARMS qPCR Mix es un kit basado en el concepto de bloque de amplificación que permite una genotipificación mediada por ARMS-PCR eficiente.

👍Alta selectividad: capaz de identificar varias mutaciones genéticas;
👍Alta sensibilidad: los cebadores mutantes pueden detectar mutaciones en concentraciones tan bajas como 0,5 % en 10 ng/L de ADN;
👍Fácil de leer: los resultados son obvios y evaluado objetivamente, y es sencillo y sin complicaciones;
👍Fácil de operar: es compatible con una variedad de equipos de PCR, el modo de operación está estandarizado y la detección a bordo puede lograrse en 90 minutos.

4. ¿Qué son los datos de rendimiento del producto?

4.1 Impacto superior del bloqueo del producto

Experimento: Se amplificaron 5 L de entrada de plantilla, 10 ng/L de plantilla de tipo salvaje y cantidades equivalentes de plásmido mutante utilizando cebadores mutantes.
Sitio: KRASG13D (38G>A)
Rojo: 13755; Azul: Competidores

La figura 2 demuestra que los cebadores de tipo salvaje amplifican tanto los moldes de tipo salvaje como los mutantes. Según la curva de amplificación, el molde de tipo salvaje no tiene pico o la diferencia en el valor Ct entre el de tipo salvaje y el mutante es de 6-8, lo que permite distinguir eficazmente los genes de tipo salvaje y mutante.

4.2 La tasa de detección del producto puede alcanzar el 0,05 %

Experimento 1: Técnica de preparación estándar de automezcla (50%): 50 μL 10 ng/μL de ADN de tipo salvaje y 50 μL 3X103 copias de plásmido mutante.
Sitio: KRASG13D(38G>A)

Figura 3. Según la curva de amplificación, el producto continúa funcionando eficazmente a una concentración de 0,05 %.

Experimento 2: El estándar adquirido al 5 % (50 ng/μL) se diluyó con diluyente de biblioteca a 10 ng/μL y luego se diluyó aún más con 10 ng/μL de 293 g de ADN al 0,1 % y al 0,05 %.
Sitio: L858R
Rojo: 13755; Azul: Competidores

Figura 4: Según la curva de amplificación, la tasa de detección de loci contra un fondo de ADNg de tipo salvaje de 10 ng/μL puede ser tan alta como 0,05%, y la validación posterior mediante estándares comerciales demuestra que nuestros productos tienen una excelente tasa de detección.

4.3 Excelente estabilidad del producto

Los efectos de amplificación y bloqueo del producto no se ven afectados por 10 ciclos de congelación y descongelación.
Experimento: rojo: -20℃; verde: congelación-descongelación genuina 5 veces; azul: congelación-descongelación genuina 8 veces; morado: congelación-descongelación genuina 10 veces.
Sitio: L858R

La figura 5 demuestra que la congelación y descongelación repetidas del reactivo 13755 diez veces no tiene influencia en sus propiedades de amplificación y bloqueo.

Sus efectos de amplificación y bloqueo no se ven afectados por 37 °C durante 7 días.
Experimento: Rojo: -20°C; Verde y morado: 37°C durante 7 días.
Sitio: L858R

La figura 6 demuestra que siete días a 37 °C no tienen influencia en la acción de amplificación y bloqueo del reactivo 13755.

5. ¿Cómo la gente pide productos?

Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd., fundada en 2014, es una empresa de alta tecnología dedicada a la investigación y desarrollo y producción de materias primas enzimáticas y anticuerpos antigénicos. Sus productos incluyen enzimas, proteínas y anticuerpos de diagnóstico molecular utilizados en productos farmacéuticos, pruebas de seguridad alimentaria, crianza, justicia y otras industrias. Estamos comprometidos a proporcionar a los clientes en el campo de las ciencias biológicas productos y servicios de alta calidad. Los productos que Yeasen puede proporcionar son los siguientes:

Tabla 1: Productos proporcionados por Yeasen