dNTP significa ribonucleótido trifosfato modelado que se utiliza en PCR y que es capaz de amplificar una cadena de ADN en crecimiento. En otras palabras, los dNTP en PCR se acoplan a cadenas de ADN complementarias a través de enlaces de hidrógeno y las cadenas de ADN en crecimiento se expanden con la ayuda de la ADN polimerasa Taq. ¿Cuál es la aplicación específica de los dNTP en PCR? ¿Cuáles son las propiedades que deben tener los dNTP de alta pureza?

1. ¿Qué son los dNTP?
2. ¿Cuál es la concentración de dNTP en la PCR?
3. ¿Cuáles son las propiedades requeridas del dNTP de alta pureza?
4. Productos relacionados y rendimiento

1. ¿Qué son los dNTP?

Los desoxinucleósidos trifosfatos (dNTP) son nucleósidos trifosfatos que contienen desoxirribosa, una cadena de nucleótidos que consta de ribosa, una base y un fosfato. Los dNTP son los bloques de construcción esenciales de las moléculas de ácido nucleico y, como tales, son componentes necesarios de las mezclas de PCR, ya que no se podría generar ADN nuevo amplificado sin ellos. Los cuatro desoxinucleótidos individuales que forman una secuencia de ADN incluyen desoxiadenosina trifosfato (dATP), desoxitimidina trifosfato (dTTP), desoxicitidina trifosfato (dCTP) y desoxiguanosina trifosfato (dGTP). Además, la calidad de los dNTP también es fundamental para el éxito de muchos procedimientos como PCR, síntesis de ADNc, qPCR, secuenciación, clonación y etiquetado de ADN.

Existen cuatro tipos de dNTP, o desoxinucleótido trifosfato, y cada uno utiliza una base de ADN diferente: adenina (dATP), citosina (dCTP), guanina (dGTP) y timina (dTTP). El uso de dNTP durante la fase de extensión proporciona bases individuales listas para incorporarse al ADN y duplicarlo, como bloques de construcción. Dado que el objetivo de la técnica es sintetizar ADN nuevo, el dNTP aporta nucleótidos a la cadena “descomprimida” utilizando la plantilla de un solo lado. Esto convierte una sola cadena de ADN en dos y puede continuar de forma exponencial mientras los reactivos permanezcan presentes hasta la etapa de retención final.

2. ¿Cuál es la concentración de dNTP en la PCR?

La PCR es una técnica in vitro de síntesis de ADN que se realiza para generar múltiples copias de un fragmento de ADN de interés para que pueda visualizarse mediante electroforesis en gel. El propósito de la PCR es hacer una gran cantidad de copias de ADN para diversas aplicaciones posteriores en la secuenciación de ADN o microarrays de ADN. Sus componentes incluyen plantillas de ADN, cebadores, tampones y ADN polimerasa Taq dNTP. Para comprender el mecanismo de la PCR, es necesario comprender la importancia y el principio de los componentes utilizados. El dNTP es uno de los componentes clave de la PCR. La función de los dNTP en la PCR es amplificar la cadena de ADN en crecimiento con la ayuda de la ADN polimerasa Taq y combinarse con la cadena de ADN complementaria a través de enlaces de hidrógeno.

El proceso de PCR se divide en tres pasos que dependen de la temperatura: desnaturalización, hibridación y extensión. Durante el paso de desnaturalización, el ADN bicatenario se desnaturaliza a ADN monocatenario. Durante el paso de hibridación, los cebadores se unen en la ubicación exacta de su secuencia complementaria, y durante el paso de extensión, la ADN polimerasa Taq añade dNTP a la cadena de ADN en crecimiento. Una vez que las cadenas se abren y los cebadores se unen al ADN monocatenario, la ADN polimerasa Taq comienza su actividad catalítica. En el siguiente paso, comienza la adición de dNTP, que se unen al complejo P-ADN con menos afinidad si está presente el nucleótido complementario exacto. Poco después de que la ADN polimerasa Taq se detenga, se producen interacciones de enlaces de hidrógeno entre las bases complementarias y los dNTP. Aquí no es el nucleótido completo al principio, sino la base (base nitrogenada) en el dNTP la que decide si se une o no.En primer lugar, si encuentra una base complementaria (A para T, G para C) en el ADN monocatenario molde, formará un enlace de hidrógeno entre ellas. Se forman tres enlaces de hidrógeno entre C y G y dos enlaces de hidrógeno entre A y T. Una vez formado el enlace de hidrógeno, la ADN polimerasa Taq cumple con la incorporación del dNTP en la cadena de ADN en crecimiento formando un enlace fosfodiéster. Ahora, después de que se forma el enlace fosfodiéster, la ADN polimerasa Taq va un paso más allá al agregar nuevos dNTP. Se forma un enlace fosfodiéster entre el 3'OH del cebador y el 5'P del dNTP. Después del enlace de hidrógeno, la ADN polimerasa Taq cataliza la reacción eliminando los fosfatos gamma y beta de los trifosfatos de los dNTP. Una vez que se completa la reacción, se liberan dos pirofosfatos (PPi). Pero la cinética exacta de la interacción de los dNTP y la ADN polimerasa Taq en las reacciones de PCR sigue siendo desconocida.

Estos cuatro nucleótidos se añaden normalmente a la reacción de PCR en cantidades equimolares para una incorporación óptima de las bases. Sin embargo, en determinadas situaciones, como la mutagénesis aleatoria por PCR, se suministran intencionadamente concentraciones de dNTP desequilibradas para promover un mayor grado de incorporación incorrecta por una ADN polimerasa que no corrige. El factor que determina la concentración mínima de dNTP es la longitud del ADN y la composición de la secuencia diana. En la reacción de PCR, el dNTP suele ser de 50-200 μmol/L. Cuando la concentración final de dNTP es superior a 50 mmol/L, puede inhibir la actividad de la ADN polimerasa Taq. Las concentraciones de los cuatro dNTP deben ser iguales para reducir la incorporación incorrecta durante la amplificación debido a la falta de un dNTP.

En las aplicaciones de PCR habituales, la concentración final recomendada de cada dNTP suele ser de 0,2 mM. En algunos casos, pueden resultar útiles concentraciones más altas, especialmente en presencia de altas concentraciones de Mg.²⁺, como Mg²⁺ Se une a los dNTP y reduce su tasa de incorporación, aumentando la tasa no específica. El dNTP contiene fosfato, que puede combinarse con Mg²⁺ para reducir la concentración de Mg libre²⁺, por lo que el cambio en su concentración afectará la concentración efectiva de Mg²⁺En condiciones de alta concentración de ADN y dNTP, el Mg²⁺ La concentración debe ajustarse en consecuencia. Además, la escasez de dNTP conduce a productos de PCR incompletos. Sin embargo, los dNTP que exceden las concentraciones óptimas pueden inhibir la PCR. Para una incorporación eficiente por parte de la ADN polimerasa, los dNTP libres deben estar presentes en la reacción en una concentración no inferior a 0,01-0,015 mM.

3. ¿Cuáles son las propiedades requeridas del dNTP de alta pureza?

Desde su descubrimiento, la reacción en cadena de la polimerasa es la herramienta sin igual que se utiliza en la investigación genética molecular. El dNTP se utiliza en la PCR para expandir la cadena de ADN en crecimiento. Incluso si la calidad del dNTP en el sistema es deficiente, tendrá un impacto negativo en las propiedades del producto final. El dNTP de alta pureza de Yeasen es adecuado para todo tipo de aplicaciones de síntesis de ADN altamente sensibles y reproducibles.

Yeasen ofrece nucleótidos, conjuntos y mezclas de grado GMP listos para usar, suministrados como sales de sodio en agua purificada a pH 7,0. El proceso de fabricación elimina las impurezas y los inhibidores específicos de PCR, y los dNTP se fabrican especialmente para aplicaciones de biología molecular. Los dNTP se purifican con HPLC preparativo y poseen al menos un 99 % de pureza. Se pueden utilizar en procesos de PCR, RT-qPCR, LAMP, etiquetado de ADN y secuenciación de ADN.
Los estrictos estándares de control y la tecnología de última generación garantizan la mejor calidad del producto. Cada lote de dNTP se analiza para detectar diversos residuos (ADN bacteriano, ADN humano, DNasa, RNasa, endonucleasa).El producto es estable de un lote a otro y es adecuado para todo tipo de aplicaciones de síntesis de ADN altamente sensibles y reproducibles.

4. Productos relacionados y rendimiento

4.1 No hay residuos de ADN bacteriano

Figura 1. Los resultados de la detección muestran que los dNTP no tienen residuos del genoma bacteriano.

4.2 No hay residuos de ADN humano

Figura 2. Los resultados de la detección muestran que los dNTP no tienen residuos del genoma humano.

4.3 Sin contaminación por DNasa, ARNasa y endonucleasa

Figura 3. Los resultados de la detección muestran que los dNTP no tienen DNasa, RNasa ni endonucleasa.

4.4 Amplificación por PCR (ADN de 20 kb)

Figura 4. El resultado de la amplificación por PCR es el producto esperado de 20 kb.

4.5 Información de los productos

Los productos proporcionados por Yeasen son los siguientes.

Tabla 1.Información de productos