A medida que las personas prestan cada vez más atención a las preocupaciones relacionadas con la salud, el campo del diagnóstico in vitro (IVD) se está desarrollando rápidamente. En particular, la aparición de COVID-19 ha acelerado la expansión del mercado de IVD. En la actualidad, la RT-qPCR se ha utilizado ampliamente en el desarrollo de productos reactivos de diagnóstico IVD, pero los reactivos de diagnóstico líquidos RT-qPCR tienen altos costos de transporte, rendimiento inestable y vida útil corta. Los reactivos de secado pueden sortear perfectamente las deficiencias de los reactivos de diagnóstico líquidos RT-qPCR. Entonces, ¿cómo se deben fabricar los reactivos de secado? ¿Cómo elegir el método de producción?

1. ¿Qué son los reactivos de secado?

2. ¿Qué es el secado al aire?

3. ¿Qué es la liofilización?

4. ¿Cuál es la diferencia entre liofilización y secado al aire?

5. Productos relacionados y rendimiento

1. ¿Qué son los reactivos de secado?

Los reactivos de secado son los reactivos obtenidos después de que la muestra se seca y se deshidrata. Los reactivos de secado pueden entregarse a temperatura ambiente y no requieren transporte en cadena de frío. Puede evitar la congelación y descongelación repetida de reactivos que afecte el rendimiento y la vida útil de los reactivos, y reduce en gran medida el costo de transporte. No solo es fácil de usar para las personas, sino que también reduce las demandas de los operadores. La industria del diagnóstico molecular está interesada en los reactivos de secado principalmente porque pueden transportarse y almacenarse a temperatura ambiente. En la actualidad, existen dos técnicas de secado ampliamente utilizadas: liofilización y secado al aire. La tecnología de secado al aire es menos costosa, mientras que la tecnología de liofilización es la más popular, y ambas tienen sus ventajas. Existen dos métodos de producción de reactivos de secado: secado al aire y liofilización. ¿Cuáles son y cómo se deben elegir?

2. ¿Qué es el secado al aire?

El secado al aire es una técnica de secado que se puede utilizar para preparar reactivos de secado. El secado al aire se divide en tres procesos: secado al aire natural, secado al aire caliente y secado al aire natural de imitación. En el proceso de producción industrial, para garantizar la estabilidad de la calidad y el rendimiento del producto, el reactivo a menudo se seca con secado al aire caliente. Para los reactivos de diagnóstico IVD, generalmente se utiliza un horno de precisión con una función de soplador o de vacío para secar el líquido a una temperatura superior a la temperatura ambiente (secado a 50 °C durante 80 minutos). El líquido se seca al aire hasta convertirse en un material seco viscoso. El proceso específico se muestra en la Figura 1.

Fig. 1. Secado con aire caliente

La clave para secar reactivos moleculares líquidos no es solo garantizar que la enzima se pueda hidratar rápidamente después del secado, sino también garantizar que la estabilidad, la sensibilidad y la especificidad de los reactivos secos no se vean afectadas. El secado al aire solo requiere un horno de precisión. En comparación con la liofilización, el equipo es más barato y el consumo de energía es menor, por lo que el costo de los reactivos es menor. Además, el proceso de secado al aire es simple y el tiempo de secado es más corto (en 2 horas). El secado al aire tiene ventajas y desventajas. Durante el proceso de secado al aire, varios componentes, incluidas las enzimas, se perderán con la evaporación del agua. No solo eso, sino que la solución de reacción y sus componentes también se verán dañados por la alta temperatura de 50 ° C. Algunos componentes también se oxidan más fácilmente, por lo que la vida útil de los reactivos secados al aire será más corta. Además, el reactivo de secado al aire tiene una fuerte viscosidad y es fácil de colgar en la pared, y tiene una capacidad de rehidratación deficiente.La liofilización puede compensar las deficiencias del secado al aire.

3. ¿Qué es la liofilización?

A diferencia del secado al aire, la liofilización es una tecnología de secado especial, cuyo principio básico se basa en el cambio de tres fases del agua. Las tres fases del agua son sólida, líquida y gaseosa, y las tres fases pueden coexistir y transformarse entre sí. Cuando la presión es mayor de 610,75 Pa, con el aumento de la temperatura, el hielo se derrite en agua y el agua se evapora y se convierte en vapor. Cuando la presión es menor de 610,75 Pa, el hielo se sublima directamente en vapor de agua mediante calentamiento. Específicamente como se muestra en la Figura 2. La liofilización utiliza el principio de transición de fase del agua. Primero, los reactivos líquidos se congelan a -30 ℃ ~ -40 ℃, de modo que la mayor parte de la humedad del material se congela en hielo. El hielo se sublima en vapor de agua a un vacío más alto, lo que proporciona una fuente de calor de baja temperatura. El vapor de agua se condensa mediante un condensador en el sistema de vacío para que el resto del material permanezca en el hielo, obteniendo así productos secos.

Fig. 2. Diagrama de fases del agua

Entonces, ¿cuáles son las principales formas de reactivos liofilizados? Los reactivos liofilizados IVD se dividen principalmente en tres formas: liofilización en frasco de penicilina, liofilización in situ y microesferas liofilizadas. Las tres formulaciones liofilizadas se muestran en la Figura 3. Las diferentes formas tienen sus ventajas y desventajas. La liofilización en frasco de penicilina es la forma más industrializada. No solo tiene líneas de producción completamente automáticas, sino que también tiene un proceso completo de verificación y control de riesgos. El proceso es el más simple y maduro. La desventaja es que el costo de un frasco de penicilina es alto y la cantidad de llenado no debe ser demasiado pequeña. Sin embargo, la cantidad de cada reactivo IVD es muy pequeña, por lo que debe llenarse para múltiples porciones o usarse varias veces a la vez. Si no se agota, debe almacenarse por separado y falta comodidad.

La liofilización in situ significa que todos los componentes del reactivo se liofilizan directamente en el kit, lo que resulta más cómodo de usar. Sin embargo, la distribución del frío y el calor en el liofilizador está sesgada y la colocación de los kits también es diferente, por lo que la consistencia de los lotes es difícil de controlar. Además, la tasa de utilización de los liofilizadores in situ es muy baja, por lo que el coste de amortización es alto. Si se realiza una gran cantidad de liofilización in situ, los polvos liofilizados se contaminarán de forma cruzada.

Fig. 3. Forma de los reactivos liofilizados

Las microesferas liofilizadas pueden lograr una cuantificación precisa, para una sola persona y una sola porción, el producto es más cómodo de usar. También se puede tratar mediante un proceso especial para evitar la absorción de humedad, lograr un almacenamiento a temperatura ambiente y resolver múltiples problemas al mismo tiempo. La desventaja es que el desarrollo de la tecnología de microesferas liofilizadas es difícil y el requisito de control del proceso es alto. Los reactivos liofilizados deben elegir la mejor forma de acuerdo con las escenas de aplicación. Las microesferas liofilizadas tienen ventajas únicas y son adecuadas para una variedad de escenas de aplicación, que son más prometedoras en el mercado.

4. ¿Cuál es la diferencia entre liofilización y secado al aire?

El proceso único de liofilización determina sus ventajas únicas. En comparación con el secado al aire, la liofilización es superior a este último en muchos aspectos. Las ventajas de la liofilización son las siguientes:

La liofilización se realiza a baja temperatura, por lo que la enzima no se desnaturalizará ni perderá actividad biológica, y la actividad biológica es completa.Dado que el secado se realiza en estado congelado, el volumen de reactivos de secado casi no cambia y la estructura original se mantiene sin encogerse. Al secar a baja temperatura, la pérdida de algunos componentes volátiles en los reactivos de secado es muy pequeña, lo que es adecuado para el secado de reactivos. Las sales inorgánicas no se precipitarán en la superficie del material durante el secado, evitando el endurecimiento de la superficie del material. El material seco es suelto y poroso, se disuelve rápida y completamente después de agregar agua y recupera su carácter original casi de inmediato. Dado que el secado se realiza al vacío con muy poco oxígeno, se protegen algunas sustancias fácilmente oxidables. El secado puede eliminar más del 95% al ​​99% de la humedad para que los productos secos se puedan almacenar durante mucho tiempo sin deteriorarse.

Las principales diferencias entre la liofilización y el secado al aire son las siguientes:

Tabla 1. Diferencias entre liofilización y secado al aire

Aunque los reactivos liofilizados cuestan más y tardan más tiempo en prepararse, los reactivos producidos por liofilización son más estables y más fáciles de usar, lo que coincide exactamente con la dirección de desarrollo de los reactivos de diagnóstico. Por lo tanto, desde la aparición de esta tecnología, se ha vuelto cada vez más popular. Se ha utilizado ampliamente en varios campos, como la detección de enfermedades, la detección de virus y patógenos, la detección de seguridad alimentaria, la detección de animales y la detección ambiental.

5. Productos relacionados y rendimiento

Las materias primas de los reactivos de diagnóstico IVD son la clave.Los materiales no liofilizados no se pueden extraer directamente de los materiales liofilizados, y cada componente debe analizarse y depurarse. Por lo tanto, Yeasen Biotechnology aumenta continuamente la inversión en este aspecto y se esfuerza por proporcionar a los clientes materias primas liofilizadas estables y de alta calidad, que lleguen rápidamente al mercado.

Los productos relacionados que Yeasen puede proporcionar se muestran en la Tabla 2:

Tabla 2. Lista de productos

El kit Hieff Unicon® V Lyo-nCoV Multiplex One Step RT-qPCR (con MgCl2) (Cat. n.° 13775) es Reactivo de diagnóstico líquido compatible con liofilización (liofilización) sin glicerol. Este producto es una opción ideal para el desarrollo de RT-qPCR multiplex que tiene estabilidad a temperatura ambiente y se puede enviar y almacenar a temperatura ambiente.

Rendimiento: La plantilla de pseudovirus se amplificó mediante RT-qPCR múltiple utilizando reactivos líquidos (rojo) y reactivos liofilizados 13775 (violeta) respectivamente. El gráfico de la izquierda es el canal FAM, el de la derecha es el canal VIC. Los resultados mostraron que la actividad de los reactivos 13775 estaba intacta después de la liofilización y aún tenía una capacidad de reacción múltiple de alta eficiencia. Específicamente, como se muestra en la Figura 4.

Fig. 4. Rendimiento del producto 13775 después de la liofilización

Los reactivos liofilizados 13775 se colocaron a 37 °C (verde) y -20 °C (azul) durante 21 días para realizar múltiples pruebas de amplificación por RT-qPCR. El gráfico de la izquierda es el canal FAM y el de la derecha es el canal VIC. Los resultados mostraron que el reactivo liofilizado todavía tenía un buen efecto de amplificación después de colocarlo a 37 °C durante 21 días. Específicamente, como se muestra en la Figura 5.

Fig. 5. Estabilidad térmica del reactivo liofilizado 13775: 37 °C durante 21 días.

6.Guía de selección de productos

Proceso	Descripción	Nombre del producto	Código SKU
Procesamiento de muestras	Digestión de proteínas	Proteinasa K	10401ES
	Extracción de ARN	DNasa I recombinante (libre de ARNasa)	10325ES
	Inhibición de la ARNasa	Inhibidor de la ARNasa murina (40 U/μL)	10603ES
Transcripción inversa	Adecuado para RT-qPCR	Transcriptasa inversa Hifair V (200 U/μL)	11300ES
		Transcriptasa inversa Hifair V (600 U/μL) libre de glicerol	11301ES
Amplificación por PCR	ADN polimerasa de arranque en caliente	Polimerasa de ADN Hieff UNICON Hotstart E-Taq	10726ES

Respecto a la lectura:

Solución de materia prima para la detección de ácidos nucleicos de COVID-19: rápida, liofilizada

Solución integral de Yeasen Biology para la detección del virus de la peste porcina africana

Virus de la peste porcina africana: solución de PCR cuantitativa de amplificación directa/mezcla maestra total