La secuenciación de próxima generación (NGS) ha mostrado perspectivas de aplicación en la investigación clínica y científica extremadamente amplias en campos como la detección de patógenos, la detección de mutaciones tumorales y la genética reproductiva debido a su alta sensibilidad de detección, fuerte especificidad y la capacidad de realizar detección tanto cualitativa como cuantitativa. La construcción de bibliotecas, como paso central en NGS, afecta directamente la calidad de la secuenciación. Con base en las pautas de revisión de registro para productos de diagnóstico in vitro (IVD), se deben proporcionar datos de investigación de las principales materias primas. Se debe realizar un análisis y verificación integrales combinando factores como la información básica, los indicadores de parámetros y las fuentes de suministro de las materias primas para determinar la fuente de materias primas más adecuada. El proceso convencional de construcción de bibliotecas de ADN y ARN incluye principalmente pasos clave como la síntesis de ADNc, la fragmentación del ADN, la ligadura del adaptador y la amplificación de la biblioteca. Los distintos pasos contienen muchos tipos de enzimas de materia prima. La selección de enzimas de materia prima alarga el ciclo de investigación. Sobre esta base, los productos modulares de construcción de bibliotecas rentables y simples se han convertido en una nueva opción para el desarrollo de productos IVD.
Figura 1. Proceso de construcción de bibliotecas de ADN convencionales (izquierda) y proceso de construcción de bibliotecas de ARN (derecha), tomando como ejemplo la plataforma Illumina
La síntesis de transcripción inversa es la parte central de ARN-Seq, Nuevo tipo de alto transcriptasa inversa de alta eficiencia, que integra múltiples funciones como alta sensibilidad, alta producir La compatibilidad del ADNc con plantillas de estructuras complejas es un tema de investigación candente. La plataforma de modificación enzimática ZymeEditor™ de Yeasen ha obtenido un producto de transcripción inversa integral con un rendimiento ampliamente mejorado a través de la modificación direccional de M-MLV. Se puede utilizar en múltiples escenarios de aplicación, como secuenciación de ARN, secuenciación de células individuales, clonación de ADNc y construcción de bibliotecas.
Figura 2. Rendimiento de 13488ES aplicado en RNA-seq
Limitado por la corta longitud de lectura de la plataforma de secuenciación, el ADN debe fragmentarse aleatoriamente antes de la construcción de la biblioteca. En la etapa inicial, la fragmentación enzimática era desalentadora debido a problemas de uniformidad y sesgo. Biotecnología Yeasen Ha desarrollado dos enzimas de fragmentación únicas, Una enzima de fragmentación de acción vigorosa que funciona a 37 ℃ durante 3-30 minutos y una enzima de fragmentación de acción suave que funciona a 30 ℃ durante 10-40 minutos. Los productos de fragmentación enzimática basados en la fragmentación aleatoria están mejorando gradualmente sus deficiencias, Se combinan en productos modulares para la fragmentación de ADN, reparación de extremos y colas A que satisfacen las numerosas demandas de diferentes muestras y diferentes tipos de secuenciación.
Figura 3. Efectos de fragmentación de diferentes enzimas de fragmentación de ADN: enzima de fragmentación de acción vigorosa (izquierda) y enzima de fragmentación de acción suave (derecha)
La tasa de conversión de la biblioteca es un indicador importante para evaluar la calidad de la biblioteca. Una tasa de conversión alta de la biblioteca significa, en cierta medida, una mayor riqueza de la biblioteca y una mejor uniformidad de los datos de secuenciación. La ligasa de ADN T4 convencional se centra en optimizar la ligadura de alta eficiencia, pero los fragmentos son propensos a la autoligación, lo que reduce la tasa de conversión de la biblioteca y afecta la riqueza de la biblioteca y la calidad de la secuenciación. La plataforma de ingeniería enzimática Yeasen ZymeEditor™ realiza una modificación direccional en la ADN ligasa T4 para obtener un nuevo mutante, Combinado con un tampón de ligadura cuidadosamente optimizado, se ha desarrollado el producto del módulo de ligadura con alta estabilidad térmica y una baja tasa de autoligadura de fragmentos, lo que mejora significativamente la tasa de conversión de la biblioteca.
Figura 4. Estabilidad térmica y análisis de residuos de enlace de 12996ES
Todas las enzimas de amplificación por PCR son necesarias en los métodos de preparación de bibliotecas NGS. La mayoría de las ADN polimerasas de alta fidelidad tienen actividad polimerasa 5'→3' y actividad exonucleasa 3'→5'. Puede sintetizar ADN en la dirección 5'→3' corrigiendo las bases incorporadas erróneamente. De esta forma, se pueden amplificar rápidamente y con gran fidelidad fragmentos de ADN. Pero pocas enzimas están diseñadas específicamente para NGS, No existen muchos productos de amplificación de biblioteca que sean eficientes, precisos, específicos y capaces de amplificar objetivos de diferentes tamaños y contenidos de GC sin sesgos, y que al mismo tiempo tengan la capacidad de premezclar cebadores con antelación. Yeasen Biotechnology ha desarrollado una ADN polimerasa de alta precisión con un diseño único y una premezcla de PCR de inicio en caliente optimizada. Está diseñada específicamente para una amplificación de biblioteca NGS eficiente, de alta fidelidad y bajo sesgo, abordando los desafíos de la amplificación de biblioteca NGS compleja.
Figura 5. Análisis de la tasa de error de amplificación y estabilidad de 12980ES
Además de la serie anterior de productos de módulos de construcción de bibliotecas NGS, También ofrecemos productos enzimáticos crudos de ventanilla única, Para satisfacer las necesidades combinadas de diferentes clientes. Los productos de materia prima para la construcción de bibliotecas NGS de Yeasen se someten a estrictos estándares de control de calidad de fábrica, estricto control de calidad de estabilidad y rendimiento de lotes, para que pueda construir bibliotecas sin preocupaciones.
| Categoría de producto | Nombre del producto | Cat.No. | Observación |
| Síntesis eficiente de ADNc | Hifair™ Transcriptasa ultrarreversa (200 U/μL) | 14604ES | Enzima de transcripción inversa |
| Alto NGS™ Kit de síntesis de ds-cDNA | 13488ES | Módulo de síntesis de ADNc | |
| ADN Fragmentación y reparación de extremos y colas A | Hieff™ Smerase | 12907ES | Fragmentasa de ADN |
| Módulo de fragmentación de ADN Hieff NGS™ OnePot Pro (reparación de extremos y dA-tailing plus) | 12619ES | ADN Módulo de fragmentación, reparación de extremos y cola A | |
| Reparación y cola A | Módulo de reparación de extremos de ritmo rápido/dA-Tailing Hieff NGS® | 12608ES | Módulo de reparación de extremos y de cola A |
| Ligadura del adaptador | 10299ES | Ligasa de ADN T4 | |
| Ampliación de biblioteca | Mezcla de amplificación HF 2× Ultima | 13344ES | Enzima de alta fidelidad |