Guía integral para el cultivo organoide

— Un artículo completo para profundizar su comprensión de los organoides.

Introducción a los organoides

Los organoides son estructuras tridimensionales con funciones fisiológicas que imitan el estado normal (o patológico) de los órganos o tejidos internos, y que se logran mediante el cultivo 3D fuera del cuerpo. En términos más simples, los organoides son cultivos celulares tridimensionales en los que las células madre se cultivan en un gel matriz. Bajo la influencia de inhibidores/activadores químicos, citocinas y aditivos de cultivo, los organoides se convierten en estructuras tisulares similares a los órganos correspondientes.

Características de los organoides

Los organoides poseen capacidades de autorrenovación, manteniendo la estructura fisiológica y la función del tejido de origen. A menudo se los denomina "microórganos en una placa". Aprovechando las capacidades de autorrenovación, diferenciación y autoorganización de las células madre, los organoides se pueden criopreservar para su uso en biobancos y pueden experimentar una expansión ilimitada. Los organoides son muy complejos y, en comparación con las células 2D, se parecen más al estado in vivo.

Figura 1. Cultivo de organoides de células de adenocarcinoma de colon humano [1]

Aplicaciones de los organoides

La característica distintiva de los organoides es su capacidad para simular mejor el entorno in vivo, lo que los hace adecuados para los análisis de biología molecular y celular. Al cerrar la brecha entre los niveles animal y celular, los organoides ofrecen una solución superior para la investigación en áreas como estudios tumorales, detección de fármacos, medicina regenerativa y más. Se han aplicado ampliamente en la inducción de tejidos funcionales, el establecimiento de modelos de enfermedades, la detección de fármacos, las pruebas antiinflamatorias, la investigación clínica y varios otros aspectos de investigación, mostrando un gran potencial tanto en la investigación básica como en las aplicaciones translacionales.

A medida que los sistemas de cultivo de organoides y las técnicas experimentales continúan evolucionando, los organoides se han utilizado para diversos tejidos y órganos, incluidos los intestinos (intestino delgado/colon), el estómago, el hígado, el corazón, los pulmones, la próstata, el páncreas, los riñones, los senos, estructuras similares al cerebro, la retina, el oído interno y más.

Los organoides derivados de células madre tumorales han demostrado un potencial significativo para comprender los mecanismos de aparición y desarrollo de tumores, evaluar la sensibilidad a los fármacos y promover la medicina de precisión y el diagnóstico personalizado. Múltiples artículos de Cell and Science indican que los organoides muestran una alta sensibilidad y especificidad para predecir la eficacia de los fármacos contra el cáncer. Recientemente, los organoides tumorales han demostrado su papel en la predicción de las respuestas de los pacientes a los fármacos contra el cáncer y en la ayuda para la formulación de planes de tratamiento personalizados.

Investigación de los mecanismos de desarrollo: Las capacidades de diferenciación de los organoides los hacen adecuados para estudiar los procesos y mecanismos del desarrollo embrionario. Los procesos de inducción regulados por vías de señalización como Wnt y BMP pueden utilizarse para estudiar el desarrollo de órganos como el cerebro, el páncreas y el estómago [2][3][4].

Establecimiento de modelos de lesiones por enfermedades: los organoides inducidos a partir de tejidos u órganos específicos se pueden utilizar para estudiar modelos de enfermedades específicas. Los equipos dirigidos por Zhao Bing y Lin Xinhua utilizaron modelos de infección de organoides humanos para estudiar los mecanismos moleculares de la infección por SARS-CoV-2 y el daño hepático, lo que proporcionó herramientas cruciales para investigar los mecanismos patogénicos del virus y el posterior desarrollo de fármacos [5]. El grupo de investigación dirigido por Deng Hongkui en la Facultad de Ciencias de la Vida de la Universidad de Pekín utilizó pequeñas moléculas y citocinas para estimular la construcción de un nuevo organoide intestinal con características de regeneración del daño: el hiperorganoide.Este organoide se puede transferir y amplificar durante un período prolongado, manteniendo el genoma y promoviendo la reparación del daño del tejido del colon, aliviando los síntomas patológicos en un modelo animal de colitis aguda y más [6].

Medicina regenerativa: los organoides derivados de células madre pueden reparar o reemplazar tejidos dañados o enfermos para restaurar la función tisular normal. Tienen amplias aplicaciones en terapia celular, incluidas otras enfermedades neurodegenerativas, diabetes, enfermedades cardiovasculares, trastornos de la retina, lesiones de la médula espinal y más. Como tratamiento novedoso en el campo de la medicina regenerativa, DA01, que utiliza moléculas pequeñas como SB-431542, LDN193189, CHIR-99021, Y-27632 y la proteína Sonic Hedgehog (Shh), estimula las células madre pluripotentes para que se diferencien en neuronas dopaminérgicas. Estas neuronas luego se trasplantan a las áreas lesionadas de los cerebros de pacientes con enfermedad de Parkinson en etapa avanzada, lo que proporciona una nueva dirección y un nuevo enfoque para el tratamiento de la enfermedad [7].

Pruebas de toxicidad y eficacia de fármacos: los organoides se pueden utilizar para verificar la farmacotoxicidad de nuevos fármacos en órganos o tejidos específicos, lo que proporciona datos que respaldan el desarrollo de nuevos fármacos. El uso de organoides renales de Hyman para verificar la toxicidad renal del cisplatino es un ejemplo [8].

Detección de fármacos: los organoides derivados de células madre se pueden utilizar para la evaluación in vitro de reacciones a fármacos, lo que proporciona un respaldo teórico para la detección de fármacos. Los organoides de colon se pueden utilizar para estudiar planes de medicación para pacientes con mutaciones CFTR, y los organoides tumorales se pueden utilizar para evaluar situaciones de medicación individualizadas para los pacientes [9].

Historia del desarrollo de los organoides

Fuentes de organoides

Los organoides normales se originan principalmente a partir de células madre, incluidas las células madre pluripotentes (PSC) y las células madre adultas (ASC). Las células madre pluripotentes incluyen las células madre embrionarias (ESC) y las células madre pluripotentes inducidas (iPSC). En comparación con las células madre pluripotentes, las células madre adultas tienen la ventaja de ser más simples y rápidas de modelar, pero la desventaja de construir estructuras organoides que son relativamente más simples. Las estructuras organoides construidas a partir de células madre pluripotentes son más complejas.

Productos utilizados en Cultivo de organoides

Moléculas pequeñas de uso común en el cultivo de organoides (resumen): ¡Súper práctico, no olvides marcarlo como favorito!

❶ Y-27632 (Cat#53006ES, Cat#52604ES): Un potente inhibidor de Rock, que inhibe competitivamente p160ROCK (Ki=140 nM) y ROCK-II (IC50=800 nM) mediante competencia de ATP.También inhibe la PRK2 (IC50=600 nM). Normalmente se añade durante la primera siembra en el cultivo en placa; los cambios de medio posteriores pueden no requerir adición. El tratamiento de células madre embrionarias humanas con Y-27632 (10 µM) durante 1 h puede inhibir la apoptosis, aumentar la eficiencia de los clones y extender los pases celulares.

Concentración de trabajo recomendada: 10 μM

❷ SB-202190 (Cat#53005ES): Un inhibidor eficaz de la quinasa p38 MAPK, dirigido a p38α/β. SB202190 puede inducir la diferenciación de células madre embrionarias humanas en células musculares cardíacas, promover la autorrenovación de células madre neurales y es aplicable al cultivo de organoides gastrointestinales y de glándulas mamarias.

Concentración de disolución recomendada: disolver 10 mg en 3,018 mL de DMSO para obtener una solución de 10 mM; conservar a -20℃.

Concentración de trabajo recomendada: 10 μM

❸ CHIR-99021 (Cat#53003ES): Un derivado de aminopirimidina que actúa como inhibidor de GSK-3 (GSK3α/β). Induce la diferenciación de células madre embrionarias humanas en el endodermo y se utiliza en cultivos de organoides de riñón y retina. CHIR-99021, cuando se utiliza en combinación con otros reactivos, estimula la reprogramación de células somáticas en células madre.

Concentración de disolución recomendada: disolver 5 mg en 3,58 mL de DMSO para obtener una solución de 3 mM; conservar a -20℃.

Concentración de trabajo recomendada: 3 μM

❹ A 83-01 (Cat#53002ES): Inhibidor de la vía activina/NODAL/TGF-β, que inhibe la actividad de la cinasa ALK5/4/7. Generalmente se utiliza en el cultivo de organoides de hígado, próstata y glándulas mamarias. Se utiliza comúnmente para inhibir la diferenciación de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) y mantener la autorrenovación de células in vitro.

Concentración de disolución recomendada: disuelva 5 mg en 5,93 mL de DMSO para obtener una solución de 2 mM; consérvese a -20 ℃. (Nota: este producto es inestable en solución y se recomienda su uso inmediato después de su preparación).

Concentración de trabajo recomendada: 2 μM

❺ Gastrina I (Cat#53007ES): La gastrina es una hormona peptídica gastrointestinal endógena que estimula las células de la pared gástrica para que secreten ácido gástrico. Es fundamental para los estudios sobre organoides gastrointestinales. Al cultivar organoides intestinales y hepáticos, la adición de gastrina ayuda a prolongar el tiempo de supervivencia de los organoides.

Concentración de disolución recomendada: disolver 1 mg en 2,38 mL de solución de amoníaco al 1% para obtener una solución de 0,2 mM; conservar a -20℃.

Concentración de trabajo recomendada: 10 nM

❻ Nicotinamida (Cat#51402ES): La nicotinamida, una vitamina B3, participa en varias reacciones redox enzimáticas y se utiliza en el cultivo de organoides gastrointestinales, hepáticos y de glándulas mamarias. La nicotinamida, junto con las citocinas y otros reactivos bioquímicos, exhibe propiedades antiinflamatorias, promueve la diferenciación de células madre mesenquimales en células productoras de insulina, inhibe la actividad de las sirtuinas y se utiliza para promover la formación de organoides y extender su vida útil.

Concentración de disolución recomendada: disolver 100 mg en 8,19 mL de H2O (o DMSO) para obtener una solución de 100 mM; conservar a -20℃.

Concentración de trabajo recomendada: 10 mM

❼ Forskolina (Cat#51001ES): La forskolina puede activar la adenilato ciclasa, comúnmente utilizada para elevar los niveles intracelulares de AMPc. La forskolina induce la diferenciación de varios tipos de células, activa PXR y FXR, y tiene efectos antiagregantes plaquetarios y antihipertensivos. Al cultivar organoides hepáticos, es esencial agregar esta sustancia.

Concentración de trabajo recomendada: 1-10 μM

❽ Prostaglandina E2 (Cat#60810ES): La prostaglandina E2 (PGE2) regula muchos sistemas fisiológicos y media la proliferación y diferenciación celular.Es necesario durante el cultivo de organoides hepáticos y prostáticos y está asociado con la relajación del músculo liso, la inflamación, la reproducción, la regulación del ciclo del sueño y la integridad de la mucosa gástrica.

Concentración de disolución recomendada: disolver 1 mg en 0,28 mL de DMSO para obtener una solución de 10 mM; conservar a -20℃.

Concentración de trabajo recomendada: 500 nM

❾ N-acetil-L-cisteína (Cat#50303ES): La N-acetil-L-cisteína (NAC) es un precursor del antioxidante glutatión, con efectos antioxidantes e inhibidores de ROS. Inhibe la apoptosis de las células neuronales y es necesaria en el proceso de cultivo de la mayoría de los organoides.

Concentración de disolución recomendada: disolver 2 g en 24,51 mL de H2O (o DMSO) para obtener una solución de 500 mM; conservar a -20℃.

Concentración de trabajo recomendada: 1 mM

Información relacionada con el producto

Referencias:

[1] Sato T, Stange DE, et al.Expansión a largo plazo de organoides epiteliales de colon humano, adenoma, adenocarcinoma y epitelio de Barrett. Gastroenterología. 2011 Nov;141(5):1762-72. doi: 10.1053/j.gastro.2011.07.050. Publicación electrónica 2011 Sep 2. PMID: 21889923.

[2] Lancaster MA, Renner M, et al. Los organoides cerebrales modelan el desarrollo del cerebro humano y la microcefalia. Nature. 2013.501(7467):373-379. http://dx.doi.org/10.1038/nature12517.

[3] Greggio C, et al. Nichos tridimensionales artificiales deconstruyen el desarrollo del páncreas in vitro. Desarrollo. 2013.140(21):4452-4462. http://dx.doi.org/10.1242/dev.096628.

[4] McCracken KW, et al. Modelado del desarrollo y la enfermedad humana en organoides gástricos derivados de células madre pluripotentes. Nature. 2014.516(7531):400-404. http://dx.doi.org/10.1038/nature13863.

[5] Zhao B, Ni C, et al. Recapitulación de la infección por SARS-CoV-2 y el daño a los colangiocitos con organoides ductales del hígado humano. Protein Cell. 2020 Oct;11(10):771-775. doi: 10.1007/s13238-020-00718-6. PMID: 32303993; PMCID: PMC7164704.

[6] Qu M, Xiong L, et al. Establecimiento de cultivos de organoides intestinales que modelan la regeneración epitelial asociada a lesiones. Cell Res. 2021 Mar;31(3):259-271. doi: 10.1038/s41422-020-00453-x. Publicación electrónica 8 de enero de 2021. PMID: 33420425; PMCID: PMC8027647.

[7] BlueRock Therapeutics anuncia el primer paciente que recibió DA01 en un estudio de fase 1 en pacientes con enfermedad de Parkinson avanzada. Comunicado de prensa de BlueRock Therapeutics: 8 de junio de 2021.

[8] Takasato M, Er PX, et al. Los organoides renales de células iPS humanas contienen múltiples linajes y modelan la nefrogénesis humana. Nature. 2015.526(7574):564-568. http://dx.doi.org/10.1038/nature15695.

[9] Spence JR, Mayhew CN, et al. Diferenciación dirigida de células madre pluripotentes humanas en tejido intestinal in vitro. Naturaleza. 2011.470(7332):105-109. http://dx.doi.org/10.1038/nature09691.