I. Principios del Western Blot
El Western Blot (WB), o inmunotransferencia de proteínas, es una técnica clásica para la detección de proteínas específicas basada en interacciones antígeno-anticuerpo, ampliamente utilizada en biología molecular, inmunología y campos afines. Sus pasos principales incluyen:
- Separación de proteínas:
- SDS-PAGE separa las proteínas desnaturalizadas por peso molecular.
- SDS recubre las proteínas con una carga negativa uniforme, eliminando las influencias estructurales.
- Transferencia de membrana:
- Las proteínas se transfieren del gel a una membrana (por ejemplo, PVDF o nitrocelulosa).
- Detección de anticuerpos:
- Los anticuerpos primarios se unen específicamente a la proteína objetivo, seguidos de los anticuerpos secundarios conjugados con enzimas (por ejemplo, HRP) que generan una señal detectable, como la quimioluminiscencia.
II. Flujo de trabajo estándar de Western Blot
| Paso | Procedimientos clave | Reactivos recomendados ( |
| 1. Preparación de la muestra | Extraer proteínas con tampón de lisis RIPA; agregar PMSF para inhibir las proteasas actividad. | Serie de tampones de lisis RIPA, PMSF |
| 2. Cuantificación de proteínas | Utilice el método BCA (Cat#20200ES) para la cuantificación; haga coincidir el tampón de dilución estándar con el tampón de muestra. | Kits de cuantificación de BCA (Cat#20200ES/20201ES) |
| 3. Electroforesis SDS-PAGE | Utilice geles prefabricados y hágalos funcionar a 150 V hasta que el tinte llegue al fondo del gel. | Geles prefabricados, tampón de carga SDS-PAGE |
| 4. Transferencia y bloqueo de membranas | Activar la membrana PVDF (Cat. n.° 36125ES) mediante remojo en metanol durante 1 min; transferencia a 300 mA durante 60 min en un baño de hielo; bloqueo a temperatura ambiente (TA) durante 1 h o uso de una solución de bloqueo rápido (Cat#36122ES) durante 10 minutos. | TraducirBuffer de respuesta, serie de membranas de PVDF |
| 5. Incubación de anticuerpos | Incubar con el anticuerpo primario a 4 °C durante la noche; el anticuerpo secundario a temperatura ambiente durante 1-2 horas; lavar con TBST 3 veces completamente. | Diluyente de anticuerpos |
| 6.Detección de proteínas | Desarrollar con ECL (Cat#36208ES). | Serie de quimioluminiscencia ECL |
Figura 1: Flujo de trabajo de Western Blot
III. Problemas comunes y soluciones
| Asunto | Posibles causas | Soluciones |
| Alto fondo  | Bloqueo incompleto | Utilice una solución de bloqueo nueva y prolongue el tiempo de bloqueo.. |
| Lavado inadecuado | Aumente la frecuencia y la duración del lavado para eliminar la unión no específica. | |
| Concentración excesiva de anticuerpos primarios | Diluir el anticuerpo a una concentración adecuada. | |
| Problemas de calidad de la muestra | Verifique la pureza y la calidad de la muestra; utilice muestras frescas. | |
| Secado de membrana | Asegúrese de que la membrana permanezca hidratada durante los pasos de incubación; asegúrese de que haya contacto total con las soluciones de reacción. | |
| Señal débil o nula  | Transferencia incompleta | Verifique la eficiencia de la transferencia y ajuste el tiempo según sea necesario. |
| Membrana de PVDF no activada | Remoje el PVDF en metanol para activarlo antes de transferirlo al tampón. | |
| Desajuste de anticuerpos primarios con la especie objetivo | Consulte la hoja de datos, compare las secuencias de inmunógenos y proteínas e incluya una Control positivo ampliamente utilizado (por ejemplo, β-actina en células de mamíferos). | |
| Incompatibilidad de anticuerpos primarios y secundarios | Asegúrese de que el anticuerpo secundario coincida con la especie huésped del anticuerpo primario. | |
| Unión de anticuerpos insuficiente | Aumente la concentración de anticuerpos y prolongue la incubación a 4 °C (por ejemplo, durante la noche). | |
| niveles bajos de antígeno | Cargue al menos 20-30 μg de proteína por carril; utilice inhibidores de proteasa y un control positivo. | |
| Baja expresión de la proteína diana | Confirme la expresión en la muestra a través de la literatura/base de datos; concentre la muestra o utilice un control de alta expresión. | |
| Bandas no específicas/Bandas múltiples  | Líneas celulares sobrepasadas que alteran los perfiles de proteínas | Utilice células de bajo número de pasajes (<15 pasajes) y ejecute controles paralelos con células de pasajes tempranos. |
| degradación de proteínas | Incluya inhibidores de proteasa en el tampón de lisis; almacene a -80 °C, evite la congelación y descongelación, utilice muestras frescas. | |
| Modificaciones postraduccionales | Consulte la literatura para conocer las modificaciones que afectan el tamaño de la banda (por ejemplo, ubiquitinación, glicosilación). | |
| Múltiples variantes de empalme | Verificar variantes de empalme a través de la literatura o bases de datos. | |
| Dímeros/multímeros de proteínas | Agregue β-mercaptoetanol fresco o DTT al tampón de carga de SDS. | |
| Contaminación proteica exógena | Compruebe si hay proteínas exógenas; cambie las líneas celulares si es necesario. | |
| Carga excesiva de muestra | Optimice la carga (20-30 μg) en función de la expresión objetivo mediante pruebas de gradiente. | |
| Formación de multímeros | Hervir las muestras durante 10 minutos para disociar los multímeros. | |
| Alta concentración de anticuerpos primarios | Reducir la concentración y/o el tiempo de incubación para evitar bandas adicionales. | |
| Alta concentración de anticuerpos secundarios | Reducir la concentración e incluir un control solo secundario para reducir la unión no específica. | |
| Detección de proteínas no reportadas o miembros de la familia | Revise la literatura o BLAST; utilice líneas celulares/tejidos recomendados. | |
| Si se verifica, ¡es posible que hayas descubierto una nueva proteína! | ||
| Bandas sonrientes  | Migración rápida, temperatura del búfer alta, sobrecarga, búfer bajo | Migración lenta, preenfriar el tampón, reducir la carga de proteína, asegurar que el tampón cubra completamente los pocillos. |
| Bandas de ceño fruncido  | Problemas con el dispositivo (por ejemplo, burbujas debajo del gel) | Ajuste la configuración para eliminar burbujas y garantizar una polimerización uniforme del gel. |
| Bandas de cola  | Poca solubilidad de la muestra, degradación, tampón reutilizado | Mezcle bien las muestras, utilice muestras frescas y prepare un tampón de ejecución nuevo. |
| Bandas con forma de mancuerna  | Gel desigual polimerización, muestras impuras | Vuelva a fundir el gel para lograr uniformidad; centrifugue las muestras antes de usar. |
| Manchas de banda  | Carga excesiva, mala calidad del gel. | Reducir el volumen de la muestra, mejorar la preparación del gel. |
| Marcas de burbujas  | Aire atrapado durante la transferencia | Eliminar las burbujas al montar el sándwich de transferencia. |
| Manchas negras desiguales  | Solución de bloqueo no disuelta, distribución desigual de anticuerpos | Disuelva completamente la solución de bloqueo, lave 3 veces con TBST y agite durante la incubación. |
| Manchas blancas  | Alta concentración de anticuerpos que agota el sustrato | Concentraciones más bajas de anticuerpos primarios/secundarios. |
4. Herramientas de selección y optimización de productos
Productos relacionados:
| Procedimientos | N.º de cat. | Nombre del producto | Presupuesto |
| Preparación de la muestra | 20101ES | Tampón de lisis RIPA (fuerte) | 100 ml |
| 20115ES | Tampón de lisis RIPA (medio) | 100 ml | |
| 20114ES | Tampón de lisis RIPA (débil) | 100 ml | |
| 20118ES | Tampón de lisis para ensayos WB/IP | 100 ml | |
| Kit de cuantificación de proteínas BCA (mejorado) | 500 toneladas/2500 toneladas/5000 toneladas | ||
| Kit de cuantificación de proteínas BCA (listo para usar) | 500 toneladas | ||
| Electroforesis SDS-PAGE | Marcador de proteína de rango regular de 3 colores Gold Band Plus (8-180 kDa) | 250 μL/2×250 μL/10×250 μL | |
| Marcador de proteínas de alto rango de 3 colores GoldBand™ (10-245 kDa) | 2×250 μL/10×250 μL | ||
| 20328ES | Kit de preparación de gel SDS-PAGE | 1 kit (30~50 geles)/ 1 kit (150~250 geles) | |
| Kit de preparación rápida de gel PAGE | Concentraciones: 8%, 10%, 12,5%, 15% | ||
| 36259ES-36280ES | Gel de proteína prefabricado Plus | Concentraciones: 8%, 10%, 12%, 4-12%, 4-20% Opciones de carga del pozo: 10 pozos, 12 pozos, 15 pozos | |
|
Transferencia y bloqueo de membranas | Membrana de PVDF de 0,45 μm (1 rollo, 30 cm × 3 m) | 1 rollo | |
| Membrana de PVDF de 0,22 μm (1 rollo, 30 cm × 3 m) | 1 rollo | ||
| Incubación de anticuerpos | 36206ES | Diluyente de anticuerpos primarios y secundarios para WB | 100 ml/500 ml |
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Detección de proteínas | Reactivo de detección Super ECL | 100 ml/500 ml | |
| Kit de sustrato quimioluminiscente ECL mejorado | 100 ml/500 ml |
V.Cómo obtener ayuda
Para la resolución de problemas personalizada o la optimización del protocolo:
- Visita:
Yeasen Página del producto Western Blot - Correo electrónico: info@yeasenbio.com
Regla de oro para el éxito: Procedimientos estandarizados + reactivos de alta calidad + validación paso a paso = ¡resultados WB reproducibles!