El kit maestro de aislamiento de ARNm Hieff NGS™ es un kit de microesferas magnéticas especialmente diseñado para la purificación de ARNm. Las microesferas de captura de ARNm son microesferas paramagnéticas de tamaño micrométrico acopladas con colas de oligo dT (poli A), que se pueden utilizar para aislar ARNm de 10 ng a 4 μg de ARN completo mediante la unión al ARNm con colas de poli A.

Presupuesto

Componentes

Almacenamiento

El producto debe almacenarse entre 2 y 8 °C durante un año y evitar la congelación.

Instrucciones

1. Materiales necesarios no incluidos

Rack magnético, tubos PCR libres de nucleasas

2. Operación

1) Equilibrar las perlas de captura de ARNm a temperatura ambiente (~ 30 min).

2) Diluir 10 ng – 4 μg de ARN total a 50 μL con agua libre de nucleasas en un tubo de PCR libre de nucleasas y colocarlo en hielo.

3) Mezcle las perlas magnéticas invirtiéndolas boca abajo o agitándolas en un vórtex. Agregue 50 μL de perlas magnéticas a 50 μL de muestra de ARN total y pipetee 6 veces para mezclar bien. Centrifugue brevemente hasta el fondo del tubo.

4) Incubar la mezcla de perlas magnéticas y ARN en un ciclador térmico y ejecutar el siguiente programa: 65°C, 5 min; 25°C, 5 min; 25°C, mantener.

5) Coloque el tubo sobre un soporte magnético. estante durante 5 minutos para separar el ARNm del ARN total. Retire con cuidado el sobrenadante.

6) Retire el tubo del imán. estante y resuspender las perlas magnéticas con 200 μL de Tampón de Lavado de Perlas. Pipetear todo el volumen hacia arriba y hacia abajo 6 veces para mezclar bien. Colocar el tubo sobre una placa magnética estante durante 5 minutos y retirar con cuidado el sobrenadante.

7) Repita el paso 6.

8) Retire el tubo del imán. estanteAgregue 50 μL de tampón Tris para resuspender las perlas magnéticas y pipetee 6 veces para mezclar bien.

9) Coloque la muestra en un ciclador térmico y ejecute el siguiente programa para eluir el ARNm: 80 °C, 2 min; 25 °C, mantener.

10) Retire la muestra del termociclador. Agregue 50 μL de tampón de unión de perlas y pipetee repetidamente 6 veces para mezclar bien.

11) Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos para permitir que el ARNm se una a las perlas magnéticas.

12) Coloque el tubo sobre el imán. Dejar reposar durante 5 minutos y retirar con cuidado el sobrenadante.

[Nota]: Se necesita una pipeta de 10 μL para aspirar el líquido restante.

13) Retire el tubo del imán. estante, resuspender las perlas magnéticas con 200 μL de Tampón de Lavado de Perlas, pipetear repetidamente 6 veces para mezclar bien. Colocar el tubo sobre el tampón magnético. estante a temperatura ambiente durante 5 minutos. Retirar y desechar todo el sobrenadante.

14) Elución final del ARNm

Esquema A: Para la reacción de transcripción de reserva

Retire el tubo Del magnético estante. Agregue 12 μL de agua libre de nucleasas y pipetear repetidamente 6 veces para mezclar bien. Coloque el tubo en el termociclador y ejecute el siguiente programa: 80°C, 2 min. Luego coloque el tubo sobre el imán. estante Inmediatamente, dejar reposar a temperatura ambiente durante 5 minutos. Una vez clarificada la solución, aspirar con cuidado 10 μL de sobrenadante en otro tubo PCR nuevo sin nucleasas.

Esquema B: Para el ARN preparación de la biblioteca

El kit 12603 se utiliza junto con el kit 12308. Consulte el producto:

Kit de preparación de biblioteca de ARNm de modo dual Hieff NGS™ Ultima -12308ES

Agregue el volumen apropiado de tampón Frag/Primer de acuerdo con las instrucciones del kit correspondiente para la construcción de la biblioteca.

Nota

1. Por su seguridad y salud, utilice bata de laboratorio y guantes desechables durante la operación.
2. Sólo para uso de investigación.
3. Asegúrese de calentar a temperatura ambiente y mezclar bien antes de usar las perlas magnéticas, de lo contrario, la eficiencia de recuperación de las muestras podría verse afectada.
4. La operación debe estar estrictamente libre de contaminación por ARNasa y ácidos nucleicos.
5. Cuando este producto se utiliza con otros reactivos, siga las instrucciones experimentales específicas para su funcionamiento.
6. Para obtener buenos resultados de purificación, es necesario tener una buena integridad del ARN total y garantizar un valor RIN >7,0.