El kit de análisis de fragmentos de ADN residuales de células huésped HEK293 está diseñado para Análisis cuantitativo de fragmentos de ADN residual HEK293 de varias longitudes en productos intermedios, semiacabados y productos finales de preparaciones biológicas. Este kit utiliza el principio de sonda de fluorescencia de qPCR para detectar de forma específica y rápida residuos de ADN HEK293 tanto por debajo como por encima de 200 pares de bases, con un límite de cuantificación de tan solo 10 fg/μL. También incluye el control de ADN HEK293 (referencia cuantitativa de ADN). Este kit se puede utilizar junto con los kits de preparación de muestras de ADN residual basados ​​en perlas magnéticas de la empresa (Gato n.° 18461ES/18462ES).

Información del producto

Componente

Almacenamiento y envío:

1. Todos los componentes se envían en hielo seco y deben almacenarse a una temperatura entre -25 °C y -15 °C al recibirlos. La vida útil es de 2 años. Los componentes A y B1, B2, B3 y B4 deben almacenarse protegidos de la luz.

2. Al recibirlo, verifique que estén presentes los 7 componentes y almacénelos inmediatamente a las temperaturas recomendadas.

Precauciones:

1. Este producto está destinado únicamente a fines de investigación.

2. Por razones de seguridad y salud, utilice bata de laboratorio y guantes desechables durante la operación.

3. Antes de utilizar este reactivo, lea atentamente el manual de instrucciones. Los experimentos deben realizarse siguiendo los procedimientos estándar, incluida la manipulación de las muestras, la preparación de las mezclas de reacción y el pipeteo.

4. Cada componente debe mezclarse completamente agitándolo suavemente y centrifugarse brevemente antes de su uso.

Instrumentos compatibles:

Incluidos, entre otros, los siguientes instrumentos: Thermo Scientific: ABI 7500, ABI Quant Studio 5, ABI Step OnePlus, Bio-Rad: módulo óptico CFX96, Tecnología médica de Shanghai Hongshi: SLAN-96S

Instrucciones de uso

1. Dilución de la referencia cuantitativa del control de ADN HEK293 y preparación de curvas estándar

El kit de análisis de fragmentos HEK293 incluye cuatro fragmentos de amplificación de diferentes longitudes: 82 pb, 133 pb, 227 pb y 515 pb. Al establecer curvas estándar, configure curvas separadas para cada fragmento de amplificación y calcule sus cantidades residuales y distribuciones relativas en función de las curvas estándar correspondientes.

Utilice el tampón de dilución de ADN que se incluye en el kit para realizar una dilución en gradiente de la referencia cuantitativa del control de ADN HEK293. Las concentraciones de dilución deben ser: 3 ng/μL, 300 pg/μL, 30 pg/μL, 3 pg/μL, 300 fg/μL y 30 fg/μL..

Los detalles son los siguientes

1)Coloque el control de ADN HEK293 y el tampón de dilución de ADN del kit en hielo para descongelarlos. Después de la descongelación completa, agite suavemente para mezclar y centrifugue brevemente (10 segundos) para recoger la solución en el fondo del tubo.

2)Prepare seis tubos de centrífuga limpios de 1,5 ml y etiquételos como Std0, Std1, Std2, Std3, Std4 y Std5.

3)En el tubo etiquetado como Std0, agregue 90 μL de tampón de dilución de ADN y 10 μL de control de ADN HEK293 para lograr una concentración de 3 ng/μL. Mezcle suavemente con un vórtex y centrifugue brevemente (10 segundos). Esta concentración se puede dividir en alícuotas y almacenar a -20 °C para uso a corto plazo (hasta 3 meses). Evite los ciclos repetidos de congelación y descongelación.

4). En los tubos etiquetados Std0, Std1, Std2, Std3, Std4 y Std5, primero agregue 90 μL de tampón de dilución de ADN a cada uno. Cada paso de dilución debe mezclarse suavemente y centrifugarse brevemente para garantizar la uniformidad. Luego realiza el gradiente diluciones como sigue:

Tabla 1: Dilución de gradiente estándar

* Para cada concentración, realice 3 réplicas. Este reactivo puede realizar pruebas dentro de un rango lineal de 300 pg/μL a 30 fg/μL. Si es necesario, el rango lineal se puede ampliar o reducir según corresponda.

** Para reducir los ciclos repetidos de congelación y descongelación y evitar la contaminación, se recomienda alicuotar y almacenar la cuantificación de ADN. sestándar a -20°C para el primer uso.

*** La dilución de ADN descongelada y sin utilizar se puede conservar a una temperatura de entre 2 y 8 °C durante un máximo de 7 días. Si no se utiliza durante un período prolongado, se debe conservar a -20 °C.

**** Para garantizar una mezcla completa de la plantilla, agite suavemente cada dilución de gradiente durante aproximadamente 1 minuto.

2. Preparación de la muestra de prueba (TS)

Prepare la muestra de prueba TS de acuerdo con la configuración del experimento, de la siguiente manera:

1) Tome 100 μL de la muestra de prueba y agréguela a un tubo de centrífuga limpio de 1,5 mL. Etiquételo como TS, realice un pretratamiento de la muestra y prepare el to Purificary el muestra de prueba.

2) Para cumplir con el requisito de analizar cuatro longitudes de extensión diferentes simultáneamente, la cantidad de muestra de prueba pretratada debe ser ≥120 μL. Por lo tanto, se recomienda preparar 2 tubos de cada muestra para el pretratamiento y, después de la extracción, mezclarlos para su uso.

3. Preparación del control de extracción negativo (NCS)

Prepare el control de extracción negativo NCS de acuerdo con la configuración del experimento, de la siguiente manera:

1) Tome 100 μL de la solución de matriz de muestra (o dilución de ADN) buffer) y agréguelo a un tubo de centrífuga limpio de 1,5 ml. Etiquételo como NCS.

2) Realice el pretratamiento de la muestra del control negativo NCS junto con el lote de muestras de prueba y prepare la solución de control negativo NCS purificada.

3) Para cumplir con el requisito de analizar cuatro longitudes de extensión diferentes simultáneamente, la cantidad de muestra de NCS pretratada debe ser ≥120 μL. Por lo tanto, se recomienda preparar 2 tubos de cada muestra de NCS para el pretratamiento y, después de la extracción, mezclarlos para su uso.

4. Preparación del Control Sin Plantilla (NTC)

Prepare el control sin plantilla NTC de acuerdo con la configuración del experimento, de la siguiente manera:

1) No se requiere control de plantilla (NTC) muestra pretratamiento, y puede prepararse a partir de la etapa de detección del contenido de ADN residual mediante qPCR.

2) Para cada tubo o pocillo, la muestra de NTC consta de 20 μL de mezcla (es decir, 15 μL de mezcla de qPCR HEK293 + 5 μL de la mezcla de cebador y sonda HEK293 correspondiente) + 10 μL de tampón de dilución de ADN. Se recomienda preparar lo suficiente para 3 pocillos replicados.

5. Sistema de reacción qPCR

Mesa 2. Sistema de reacción para Fragmento de 82 pb

Mesa 3. Sistema de reacción para 133 fragmento de bp

Mesa 4. Sistema de reacción para 227 fragmento de bp

Mesa 5. Sistema de reacción para 515 fragmento de bp

* Para calcular la cantidad total de mezcla necesaria para esta reacción en función del número de pocillos:

Mezcla = (Número de pocillos de reacción + 2) × (15 + 5) μL (para tener en cuenta la pérdida de los 2 pocillos). Normalmente, se preparan 3 pocillos replicados para cada muestra.

** Número de pocillos de reacción = (5 pocillos de curva estándar de gradiente de concentración + 1 control sin plantilla (NTC) + 1 solución de control negativo (NCS) + N muestras de prueba (TS)) × 3.

NTC (sin control de plantilla): tampón de dilución de ADN

NCS (solución de control negativo): solución de matriz de muestra o tampón de dilución de ADN después de la preparación de la muestra.-tratamiento para obtener la solución purificada, que es el NCS.

TS (Muestra de prueba): La muestra que se va a probar.

***Después de dispensar las muestras y sellar los tubos, centrifugue brevemente a baja velocidad (10 segundos) para recoger el líquido de las paredes del tubo hasta el fondo. Luego, agite en vórtex durante al menos 5 segundos para mezclar bien. Después, realice otra centrifugación a baja velocidad (10 segundos). Si hay burbujas, asegúrese de eliminarlas.

Tabla 6: Disposición de la placa de referencia

Este ejemplo espectáculoEs el procedimiento de detección mediante qPCR para analizar los fragmentos de amplificación del ADN residual de HEK293.Las muestras de prueba incluyen: 5 gradientes de concentración de la curva estándar de ADN HEK293, 1 muestra de prueba (TS), 1 solución de control negativo (NCS) y 1 control sin plantilla (NTC). Se recomienda ejecutar 3 pocillos de réplica para cada muestra.

6. Parámetros del programa de amplificación (Ttres-Método paso a paso) (Ejemplo utilizando el instrumento qPCR ABI 7500, versión de software 2.0)**

1) Cree un nuevo programa en blanco y seleccione "Cuantificación absoluta" como plantilla de detección.

2) Para las cuatro longitudes de fragmentos de amplificación diferentes, cree nuevas sondas de detección y nómbrelas "HEK293-82", "HEK293-133", "HEK293-227" y "HEK293-515". Seleccione el fluoróforo indicador como "FAM" y el fluoróforo extintor como "ninguno". Establezca el colorante de referencia para la detección como "ROX" (el colorante de referencia puede agregarse o no según el modelo del instrumento y otros factores).

3) En el panel "Asignar objetivo(s) a los pocillos seleccionados", configure el campo "Tarea" para los pocillos de la curva estándar como "Estándar" y asigne los valores correspondientes en el campo "Cantidad" como "300000", "30000", "3000", "300", "30" (que representan la concentración de ADN por pocillo, en fg/μL). Nombre los pocillos en el campo "Nombre de la muestra" como "300 pg/μL", "30 pg/μL", "3 pg/μL", "300 fg/μL", "30 fg/μL". Para los pocillos NTC, configure la "Tarea" como "NTC". Para los pocillos NCS y TS, configure la "Tarea" como "Desconocido" y nombre los pocillos "NCS" y "TS" en el campo "Nombre de la muestra". Después de configurar estos parámetros, haga clic en "Iniciar ejecución" para comenzar la ejecución del instrumento.

4) Configuración del programa de amplificación: Configure el programa de amplificación de tres pasos, con un volumen de reacción de 30 μL.

Mesa7. Procedimiento de PCR

7. Análisis de resultados de qPCR

1) En el panel "Análisis", bajo "Gráfico de amplificación", el sistema establecerá automáticamente el "Umbral". A veces, el "Umbral" predeterminado está demasiado cerca de la línea base, lo que provoca una variación significativa de Ct entre réplicas. Puede ajustar manualmente el "Umbral" a una posición adecuada y hacer clic en "Analizar". En este punto, puede verificar preliminarmente las curvas de amplificación en el "Gráfico de componentes múltiples" para ver si son normales.

2) En el panel "Análisis" en "Curva estándar", puede leer el R² de la curva estándar, la eficiencia de amplificación (Eff%), la pendiente y la intersección. Para una curva estándar normal: R² > 0,99, eficiencia de amplificación (90% ≤ Eff% ≤ 110%) y pendiente entre -3,6 y -3,1.

3) En el panel "Análisis", en "Ver tabla de pocillos", puede leer la columna "Cantidad" para el control sin plantilla (NTC), el control negativo (NCS) y las muestras de prueba (TS), con la unidad en fg/μL. Las unidades se pueden convertir más adelante en el informe.

4) La configuración de los parámetros para el análisis de resultados debe depender del modelo específico del instrumento y de la versión del software. Por lo general, el instrumento puede interpretar automáticamente los resultados.

5) El valor Ct del control negativo (NCS) debe ser mayor que el valor Ct promedio de la concentración más baja de la curva estándar.

6) El resultado del control sin plantilla (NTC) debe ser “Indeterminado” o tener un valor Ct ≥ 32.

Documento

Manual