میتوکندری

میتوکندری ها کارخانه های انرژی سلول، محل اصلی فسفوریلاسیون اکسیداتیو درون سلولی و سنتز آدنوزین تری فسفات (ATP) هستند که انرژی را برای فعالیت های سلولی فراهم می کند. 95 درصد انرژی مورد نیاز برای فعالیت های حیات سلولی از میتوکندری تامین می شود. علاوه بر تامین انرژی برای سلول ها، میتوکندری ها در فرآیندهایی مانند تمایز سلولی، انتقال اطلاعات سلولی و آپوپتوز نیز نقش دارند و دارای توانایی تنظیم رشد سلولی و چرخه سلولی هستند. بنابراین، سنجش هایی مانند میتوکندری و غشاهای میتوکندریایی بخش مهمی از مطالعه سلول ها هستند.

تعریف و اهمیت پتانسیل غشای میتوکندری

پتانسیل غشای میتوکندری نتیجه توزیع بار در دو طرف غشای داخلی میتوکندری است و یک عامل کلیدی در حفظ عملکرد طبیعی میتوکندری است. در میتوکندری، زنجیره انتقال الکترون یک گرادیان پروتون را از طریق واکنش‌های ردوکس ایجاد می‌کند که باعث سنتز ATP می‌شود. پایداری پتانسیل غشای میتوکندری به طور مستقیم با تامین انرژی سلول و وضعیت بقای آن مرتبط است. تعداد زیادی از مطالعات نشان داده اند که میتوکندری ها ارتباط نزدیکی با آپوپتوز دارند، که در آن کاهش پتانسیل گذر غشایی میتوکندری به عنوان یکی از اولین رویدادها در فرآیند واکنش آبشاری آپوپتوز در نظر گرفته می شود. قبل از ظهور ویژگی های آپوپتوز (تراکم کروماتین، شکسته شدن DNA) در هسته رخ می دهد و هنگامی که پتانسیل گذر غشایی میتوکندری فرو می ریزد، آپوپتوز برگشت ناپذیر است. بنابراین، کاهش پتانسیل غشای میتوکندری یک رویداد مشخص در مراحل اولیه آپوپتوز است.

اصل کار کاوشگر JC-1

JC-1 یک رنگ فلورسنت لیپیدی کاتیونی است که می تواند به عنوان شاخص پتانسیل گذرنده میتوکندری استفاده شود. JC-1 در دو حالت مونومر و مولتیمر وجود دارد. در غلظت کم، به عنوان یک مونومر وجود دارد، و فلورسانس سبز را می توان تشخیص داد، و هنگامی که با روش flow-through تشخیص داده شد، معمولاً در کانال FL-1 (همان کانال FITC) قرار دارد. در غلظت بالا، به عنوان یک مولتیمر وجود دارد و نور قرمز قابل تشخیص است. و هنگامی که با روش flow-through تشخیص داده شود، معمولاً در کانال FL-2 (همان کانال PE) قرار دارد. JC-1 همچنین می تواند به عنوان یک رنگ فلورسنت لیپیدی کاتیونی استفاده شود و می تواند به عنوان یک شاخص پتانسیل گذرنده میتوکندری استفاده شود. و PE همان کانال). با توجه به تغییر غلظت JC-1، یک فرآیند انتقال برگشت پذیر بین مونومر و مولتیمر تشکیل می شود.

در سلول های نرمال، زمانی که پتانسیل غشاء طبیعی است، JC-1 از طریق قطبیت غشای میتوکندری وارد میتوکندری می شود و به دلیل افزایش غلظت، مولتیمرهای فلورسنت قرمز را تشکیل می دهد، در حالی که در سلول های آپوپتوز، پتانسیل گذر غشایی میتوکندری دپلاریزه می شود و JC-1 از میتوکندری آزاد می شود و به شکل تک فلومر سبز در غلظت کاهش می یابد. بنابراین، تغییرات پتانسیل غشای میتوکندری را می توان با تشخیص فلورسانس سبز و قرمز تشخیص داد.

توجه: تصاویر به نقل از اینترنت

کاوشگر JC-10

JC-10یک مشتق از JC-1، یک پروب وابسته به پتانسیل است که برای تعیین پتانسیل گذر غشایی میتوکندری توسط فلوسیتومتری، میکروسکوپ فلورسانس و سنجش فلورسانس مبتنی بر صفحه میکروتیتر استفاده می‌شود. در سلول‌های سالم، JC-10 به‌طور انتخابی در میتوکندری‌ها تجمع می‌یابد و دانه‌های قرمزی تولید می‌کند که طیف تحریک گسترده‌ای را نشان می‌دهند و مقادیر زیادی را در طول موج ۵۹۰ نانومتر منتشر می‌کنند.با این حال، در سلول‌های آپوپتوز و نکروزه با پتانسیل گذرنده میتوکندری کم، JC-10 از میتوکندری منتشر می‌شود و مونومرهای JC-10 را تولید می‌کند و در نتیجه به سمت انتشار سبز (525 نانومتر) حرکت می‌کند. این با موفقیت به عنوان شاخص پتانسیل گذرنده میتوکندری در انواع مختلف نمونه از جمله میوسیت ها، نورون ها، بافت های دست نخورده و میتوکندری های جدا شده استفاده شده است.

JC-10--جایگزینی برای JC-1

پایداری: JC-10 بایاس تشخیص کمتری دارد زیرا در محیط های آبی حلالیت و حساسیت بالاتری دارد.
سیگنال پیشرفته: JC-10 نسبت سیگنال به پس زمینه بالاتری نسبت به JC-1 دارد.
حساسیت افزایش یافته: JC-10 قادر به تشخیص تغییرات ظریف در از دست دادن پتانسیل گذر غشایی میتوکندری بهتر از JC-1 در تمام رده های سلولی آزمایش شده است.
کاربرد گسترده: JC-10 را می توان در سلول های کبدی اولیه موش استفاده کرد.
راحت: JC-10 با نشانگرهای آنزیمی فلورسنت، تصویرگرهای سلولی و فلوسیتومترها سازگار است.

یادداشت ها:. تغییرات پتانسیل غشای میتوکندری ناشی از کومدون ها در سلول های Jurkat با JC-10 و JC-1 اندازه گیری شد. پس از تیمار سلول های جورکات با کمپتوتسین (10 میلی مولار) به مدت 4 ساعت، محلول های نمونه برداری رنگ JC-1 و JC-10 به چاهک ها اضافه و به مدت 30 دقیقه انکوبه شدند. شدت فلورسانس فرم های تجمعی و مونومر JC-1 و JC-10 در Ex/Em = 490/525 نانومتر و 490/590 نانومتر با استفاده از برچسب آنزیم NOVOstar (BMG Labtech) اندازه گیری شد.

تجزیه و تحلیل نتایج

هنگام تشخیص مونومر JC-1، نور تحریک را می توان روی 490 نانومتر و نور انتشار را روی 530 نانومتر تنظیم کرد. هنگام تشخیص پلیمر JC-1، نور تحریک را می توان روی 525 نانومتر و نور انتشار را روی 590 نانومتر تنظیم کرد. آپوپتوز توسط فلوسیتومتری، فلورسانس سبز از طریق کانال FL-1 و فلورسانس قرمز از طریق کانال FL-2 تشخیص داده شد. FL-1+، FL-2 + سلول های طبیعی و FL-1+، FL-2- سلول های آپوپتوتیک هستند.

توجه: منبع تصویر تالارهای گفتمان وب سایت China Streamline Association است

بدون شک عمل کنید

س: پروب فلورسنت بالقوه غشای میتوکندری JC-1، آیا می توان از این محصول برای رنگ آمیزی بخش های بافت استفاده کرد؟

پاسخ: بافت زنده را به سلول های جداگانه هضم کنید تا از فعالیت سلول ها قبل از رنگ آمیزی اطمینان حاصل شود.

س: آیا می توانم سلول ها را قبل از رنگ آمیزی با JC-1 تعمیر کنم؟

پاسخ: رنگ JC-1 به روشی وابسته به پتانسیل در میتوکندری تجمع می یابد و می تواند برای شناسایی سلول ها، بافت ها یا پتانسیل های غشای میتوکندری خالص شده استفاده شود. بی‌حرکتی پتانسیل الکتریکی را مختل می‌کند و در نتیجه کاوشگر قادر به تجمع بر روی میتوکندری نیست و ویژگی را از دست می‌دهد.

س: در محلول کاری JC-1 ذرات تجمع یافته وجود دارد و من قصد دارم قبل از رنگ آمیزی آنها را با سانتریفیوژ حذف کنم، آیا پارامترهای توصیه شده برای سانتریفیوژ وجود دارد؟

پاسخ: محلول کاری JC-1 را می توان در 13000 گرم به مدت 1-2 دقیقه سانتریفیوژ کرد.

اطلاعات سفارش

نام محصول	شماره مورد	مشخصات
پروب فلورسنت بالقوه غشای میتوکندری JC-1	40705ES03/08	1 میلی گرم / 5 میلی گرم
پروب فلورسنت بالقوه غشای میتوکندری JC-10	40707ES03/08	1 میلی گرم / 5 میلی گرم

مقاله قبلی مقاله بعدی

سنجش امضا برای آپوپتوز اولیه: JC-1 ، JC-10