اصل تشخیص

توزیع فسفولیپیدها در غشای سلولی طبیعی نامتقارن است. فسفاتیدیل سرین (PS) در سطح داخلی غشای سلولی در سلول های زنده قرار دارد و در طی آپوپتوز، غشای سلولی دستخوش تغییر می شود و PS از سطح داخلی غشای سلولی به سطح بیرونی غشای سلولی برگردانده می شود. Annexin V به طور خاص PS را روی سطح سلول های آپوپتوز تشخیص می دهد، در حالی که PS از سلول های زنده در سطح داخلی غشای سلولی قرار دارد و قادر به اتصال خاص به Annexin V نیست.

PS سلول های نکروزه نیز از سطح داخلی غشای سلولی به سطح بیرونی غشای سلولی می چرخد ​​و Annexin V نیز PS را در سطح سلول های نکروزه تشخیص می دهد، بنابراین Annexin V قادر به تشخیص سلول های نکروزه و آپوپتوز نیست. در مقابل، رنگ PI قادر به اتصال به DNA داخل سلولی و تمایز بین سلول های نکروز و سلول های زنده بود. غشای سلولی سلول‌های آپوپتوز اولیه و سلول‌های زنده هنوز دست نخورده است و رنگ PI نمی‌تواند آزادانه از غشای سلولی عبور کند تا وارد سلول شود و به DNA متصل شود، بنابراین رنگ PI نمی‌تواند سلول‌های آپوپتوز و سلول‌های زنده را برچسب‌گذاری کند، در حالی که رنگ PI قادر است از غشای سلولی سلول‌های نکروزه عبور کرده و به سلول‌های نکروزه و DNA در سلول‌های نکروتیک متصل شود. فلورسانس پس از تحریک توسط لیزر 488 نانومتری که توسط کانال مربوطه دریافت می شود. بنابراین Annexin V و PI می توانند به طور همزمان برای تمایز بین سلول های زنده، سلول های آپوپتوز اولیه و سلول های آپوپتوز یا نکروز دیررس مورد استفاده قرار گیرند.

شکل 2 اصل تشخیص Annexin V / PI

تشخیص فلوسیتومتری

حداکثر طول موج تحریک FITC 488 نانومتر، حداکثر طول موج انتشار 525 نانومتر است و فلورسانس سبز FITC در کانال FL1 تشخیص داده می شود. حداکثر طول موج تحریک کمپلکس PI-DNA 535 نانومتر، حداکثر طول موج انتشار 615 نانومتر است و فلورسانس قرمز PI در کانال FL2 یا FL3 شناسایی می‌شود. تجزیه و تحلیل با نرم افزاری مانند CellQuest انجام شد و نمودار پراکندگی دو رنگ با FITC به عنوان مختصات افقی و PI به عنوان مختصات عمودی ترسیم شد. در آزمایش‌های معمولی، سلول‌ها را می‌توان به سه زیرجمعیت تقسیم کرد که سلول‌های زنده فقط دارای فلورسانس پس‌زمینه با شدت بسیار پایین، سلول‌های آپوپتوز اولیه فقط فلورسانس سبز قوی و سلول‌های آپوپتوز دیررس دارای رنگ‌آمیزی مضاعف با فلورسانس سبز و قرمز هستند.

شکل 3 تشخیص فلوسیتومتری

سوالات متداول

س: آیا می توان از سنجش آپوپتوز Annexin V برای گیاهان یا باکتری ها (پروکاریوت ها) استفاده کرد؟

پاسخ: بله، اما تهیه پروتوپلاست ضروری است زیرا سلول های گیاهی یا باکتری ها (پروکاریوت ها) دارای دیواره سلولی هستند. دوز مشخص محلول رنگ آمیزی فقط نیاز به غوطه ور شدن سلول ها دارد و زمان رنگ آمیزی برای سلول های مختلف تا حدودی متفاوت است.

س: چگونه نتیجه آزمایش را قضاوت کنیم؟

پاسخ: سلول های زنده (Annexin V-/PI-)، سلول های آپوپتوز اولیه (Annexin V+/PI-)، سلول های آپوپتوز دیررس و سلول های نکروز مثبت مضاعف (Annexin V+/PI+)، هسته های برهنه (Annexin V-/PI+) نشان می دهند.

س: تفاوت بین Annexin V و TUNEL چیست؟

پاسخ: برچسب گذاری انتهایی دئوکسی نوکلئوتیدیل ترانسفراز dUTP (TUNEL) یک روش رنگ آمیزی است که برای شناسایی محل های تکه تکه شدن DNA داخل سلولی استفاده می شود - یکی از ویژگی های بارز آپوپتوز دیررس.

رنگ آمیزی Annexin V مراحل اولیه آپوپتوز را با اتصال به باقیمانده های PS که در خارج از سلول قرار گرفته اند به دلیل از دست دادن عدم تقارن غشای سلولی تشخیص می دهد.

س: آیا انجام سنجش تنها با استفاده از Annexin V-FITC بدون تشخیص PI ممکن است؟

پاسخ: بله، ممکن است. برای نمونه‌های آزمایشی خاص، مانند گلبول‌های قرمز بدون هسته، یا استفاده از داروی دوکسوروبیسین (آدریامایسین) که در تشخیص PI اختلال ایجاد می‌کند، می‌توان در هر دو مورد آن را تنها با استفاده از Annexin V-FITC انجام داد.

جزئیات محصول

نام محصول	شماره مورد	مشخصات
کیت تشخیص آپوپتوز Annexin V-FITC/7-AAD	40311ES20/50/60	20T/50T/100T
کیت تشخیص آپوپتوز Annexin V-FITC/PI	40302ES20/50/60	20T/50T/100T
کیت تشخیص آپوپتوز Annexin V-PE/7-AAD	40310ES20/50/60	20T/50T/100T
کیت تشخیص آپوپتوز Annexin V-EGFP/PI	40303ES20/50/60	20T/50T/100T
کیت تشخیص آپوپتوز Annexin V-YSFluor™ 488/7-AAD	40313ES60	100T
کیت تشخیص آپوپتوز Annexin V-YSFluor™ 488/PI	40305ES20/50/60	20T/50T/100T
کیت تشخیص آپوپتوز Annexin V-YSFluor™ 647/PI	40304ES20/50/60	20T/50T/100T
کیت تشخیص آپوپتوز Annexin V-YSFluor™ 647/7-AAD	40312ES20/50/60	20T/50T/100T
کیت تشخیص آپوپتوز TUNEL (FITC)	40306ES20/50/60	20T/50T/100T
کیت تشخیص آپوپتوز TUNEL (YSFluor™ 488)	40307ES20/50/60	20T/50T/100T
کیت تشخیص آپوپتوز TUNEL (YSFluor™ 640)	40308ES20/50/60	20T/50T/100T