Chers amis, vous sentez-vous désemparés face à divers anticorps de contrôle de chargement et de marquage d'épitopes lors de l'immunoblotting des protéines ? Contrôle de chargement Les protéines sont codées par des gènes domestiques dans les organismes et sont exprimées de manière stable dans de nombreux tissus. Elles sont utilisées pour vérifier si les expériences immunologiques se déroulent normalement et comme norme de détection semi-quantitative pour l'expression des protéines. Alors, comment choisir correctement les anticorps de contrôle de chargement ? Vous pouvez vous référer aux points suivants.
I. Origine des espèces échantillonnées
- Pour les échantillons provenant de tissus ou de cellules de mammifères, choisissez généralement la β-actine, l'α-tubuline, la GAPDH, la lamin-B, l'histone H3, la Na+/K+-ATPase.
- Pour les échantillons d’origine végétale, choisissez généralement l’actine végétale, la Rubisco, etc.
- Pour d’autres échantillons nécessitant moins de recherche, choisissez la protéine appropriée comme référence interne en consultant la littérature ou les bases de données pertinentes.
Assurez-vous que le poids moléculaire de la protéine cible diffère de celui du contrôle de chargement de plus de 5 KDa pour éviter toute interférence lors de la détection. Par exemple, si la protéine cible est de 40 KDa, il n'est pas approprié de choisir la β-actine (42 KDa) comme contrôle de charge. Envisagez d'utiliser la GAPDH (36 KDa) ou la β-tubuline (55 KDa) comme contrôle de charge.
III. Site d'expression de la protéine de référence interne
Remarque : évitez les situations suivantes lors de l'utilisation chargement des anticorps de contrôle
| Localisation subcellulaire | Contrôle de chargement de la protéine | Poids moléculaire (KDa) | Remarques |
| Cytoplasme, cellule entière | β-actine | 42 | Ne convient pas aux extraits nucléaires. La β-actine est un composant des complexes de remodelage de la chromatine ; elle peut ne pas convenir aux situations où il existe des différences d'âge importantes entre les sujets de recherche. |
| α-Tubuline | 55 | Ne convient pas aux situations où il existe des différences d'âge importantes entre les sujets de recherche. L'expression de la tubuline change avec les médicaments antimicrobiens et antimitotiques, elle n'est donc pas adaptée à l'ajout de médicaments anticancéreux et antifongiques. | |
| β-Tubuline | 55 | ||
| GAPDH | 36 | L'hypoxie cellulaire entraîne une augmentation de l'expression de GAPDH, elle n'est donc pas adaptée aux études liées à l'oxygène. Des facteurs tels que le diabète peuvent entraîner une augmentation de l'expression de GAPDH. | |
| Vinculine | 117 | Peut être utilisé pour les protéines de poids moléculaire élevé. | |
| Mitochondries | Série COXIV | 15-17 | Cette série de protéines est principalement concentrée à 15-17 KDa. Si le poids moléculaire de la protéine cible est proche, envisagez d'autres anticorps de contrôle de charge. |
| HSP60 | 60 |
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| Noyau | VDAC1/2 | 31-37 | Cette série de protéines est principalement concentrée à 31-37KDa. |
| Lamine B1 | 66 | Ne convient pas aux cellules souches embryonnaires, ne convient pas comme contrôle de chargement dans les expériences d'apoptose. | |
| PCNA | 36 | Ne convient pas aux cellules non proliférantes. | |
| TBP | 33-43 | Le TBP est de 37 à 43 kDa chez l'homme et de 33 à 36 kDa chez la souris et le rat, ce qui ne convient pas aux expériences d'apoptose. | |
| YY1 | 65-70 |
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| Histone H3 | 17 | La plupart des protéines ont un poids moléculaire d'environ 17 kDa. Si le poids moléculaire de la protéine cible est proche, envisagez d'autres anticorps de contrôle de charge. | |
| Sang total, sérum, plasma | Transferrine | 77 | L’expression est affectée par certains états pathologiques et traitements, tels que l’acide rétinoïque. |
| Albumine | 66 | Le contenu est extrêmement élevé, faites attention à réduire la charge d'échantillon dans les expériences WB. |
Les anticorps d'étiquetage fonctionnent mieux lorsqu'ils sont utilisés ensemble
Dans les expériences d'étude des interactions protéiques, telles que le pull-down, les marqueurs d'épitopes peuvent être fusionnés à l'extrémité N ou C de la protéine cible par des méthodes de biologie moléculaire. Les marqueurs d'épitopes couramment utilisés comprennent His, HA, Myc et GST. Ces marqueurs d'épitopes n'affectent généralement pas l'activité biologique et la localisation intracellulaire de la protéine cible. L'émergence des marqueurs d'épitopes a facilité la recherche scientifique et la production industrielle.
| Étiquette d'épitope | Séquence de balises | Poids moléculaire (KDa) |
| Balise HA | YPYDVPDYA | 1.1 |
| Étiquette Myc | EQKLISEEDL | 1.2 |
| Étiquette de drapeau | DYKDDDDK | 1 |
| Étiquette GST | - | 26 |
| Étiquette GFP | - | 26,9 |
| Balise V5 | GKPIPNPLLGLDST | 1.4 |
| Cerf | KETAAAKFERQHMDS | 1.8 |
| Étiquette électronique | GAPVPYPDPLEPR | 1.4 |
Informations sur le produit
| Taper | Nom du produit | Poids moléculaire (KDa) | Numéro de produit |
| Contrôle de chargement de l'anticorps | β-actine, anticorps monoclonal de souris | 42 | 30101ES |
| β-actine, pAb de lapin | 42 | 30102ES | |
| GAPDH (Clone:1A6), anticorps monoclonal de souris | 36 | 30201ES | |
| GAPDH, pAb de lapin | 36 | 30202ES | |
| α-Tubuline, mAb de souris | 50-55 | 30304ES | |
| β-Tubuline, anticorps monoclonal de souris | 50-55 | 30301ES | |
| β-Tubuline, pAb de lapin | 50-55 | 30302ES |