1 Le principe d'action de la généticomycine

La génétomycine (généticine, G418) est un antibiotique aminoglycoside qui inhibe la synthèse des protéines en bloquant l'extension de la chaîne peptidique par liaison aux ribosomes 70S et 80S dans les cellules procaryotes et eucaryotes. Ce mécanisme est toxique pour les bactéries, les levures, les plantes et les cellules de mammifères. Lorsque les cellules ont été transfectées avec succès et intégrées à un gène de résistance à la néomycine (comme le gène néo), l'aminoglycoside phosphotransférase codée par le gène (APH (3) II) pourrait modifier de manière covalente le G418 pour l'inactiver, conférant ainsi une résistance aux cellules cultivées dans un milieu sélectif contenant du G418.

Dans les tests de génétique moléculaire, le G418 est l’un des gènes couramment utilisés pour la transfection stable.

2 L'application de la généomycine

2.1 Criblage de lignées cellulaires transfectées stables

• Le G418 a été utilisé pour rechercher des cellules contenant des gènes de résistance (par exemple, les gènes néo) en inhibant la synthèse des protéines. L'aminoglycoside phosphotransférase codée par le gène de résistance inactive le G418, ce qui confère aux cellules une résistance au G418. En règle générale, la plage de criblage des cellules de mammifères est de 200 à 2 000 μg/mL, la concentration de travail la plus couramment utilisée étant de 100 à 700 μg/mL. Lorsque les cellules végétales sont de 10 à 100 μg/mL et les cellules de levure de 500 à 1 000 μg/mL, les concentrations suivantes sont utilisées pour certains types de cellules en utilisant le G418 comme référence.

Cellule	Application	Concentration d'activation de la généomycine (μg/mL)	Ouvrages cités
Espèces de Mucor	a) Cultivé dans un milieu de croissance b) Cultivé sur des bactéries lyophilisées	a) 10 μg/mL b) 30 μg/mL	Hirth et al., Proc. Natl. Acad. Sci., v. 79, 7356-7360 (1982).
Mammifère	a) Pour le dépistage b) Pour maintenir la croissance	a) 400 à 1 000 μg/mL b) 200 μg/mL	Canaani et Berg, Proc. Natl. Acad. Sci., v. 79, 5166-5170 (1982).
Usine	a) Pour le dépistage b) Pour maintenir la croissance	a) 25-50 μg/mL b) 10 μg/mL	Ursic et al., Comm. de biochimie, de biophysique et de recherche, v. 101:3, 1031-1037 (1981).
Levure	a) Pour le dépistage b) Pour maintenir la croissance	a) 500 μg/mL b) 125-200 μg/mL	Jiménez et Davies, Nature, v. 287, 869-871 (1980).
Bactéries	Pour le dépistage	16 μg/mL	Waitz et al., Agents antimicrobiens, chimiothérapiques, v. 6:5, 579-581 (1974).

2.2 Inactivation et transfert de gènes

• Dans le cadre de l'inactivation d'un gène, le G418 peut être utilisé pour sélectionner des cellules qui inactivent avec succès le gène cible. Dans le cadre du transfert de gènes, le G418 facilite l'intégration de gènes étrangers dans le génome des cellules hôtes.

2.3 Sélection de résistance dans la culture cellulaire

• Lors de la culture cellulaire, le G418 est utilisé pour rechercher des cellules résistantes à l’antibiotique, qui portent souvent des gènes de résistance spécifiques.

3 Procédures expérimentales pertinentes pour la généomycine

3.1 Préparation de la solution mère G418 (50 mg/mL, concentration active)

1) Conversion des unités d'activité

Convertir à l'aide de la formule : (1000/A0) × A1 = A2, où A0 est la concentration de G418, qui varie selon le lot. Se reporter au rapport de contrôle qualité du lot correspondant ou à l'étiquette sur le flacon. A1 est la concentration active souhaitée de G418 à préparer. A2 est la concentration réelle en poudre par rapport au volume à peser.

Par exemple, si le lot de G418 a une puissance de 750 U/mg et que vous souhaitez préparer une concentration active de 50 mg/mL, alors la concentration réelle de poudre à préparer est de 1000/750 × 50 mg/mL = 66,67 mg/mL.

Si vous préparez 10 mL de solution mère de G418 (concentration active, 50 mg/mL), 666,7 mg de poudre sont nécessaires.

• Stérilisation et stockage

En fonction du poids réel de poudre obtenu à partir de la conversion ci-dessus, ajoutez-le à 10 ml d'eau déionisée stérile pour le dissoudre complètement.

Tout d'abord, préhumidifiez un filtre à seringue de 0,22 μm avec 5 ml d'eau déionisée stérile, en éliminant toute l'eau. Filtrez ensuite à l'aide de ce filtre pour stériliser et aliquoter en petits volumes à usage unique (par exemple, 1 ml) et conservez à -20 °C pour une stabilité d'un an.

3.2 Établissement de la courbe de mortalité

1) Premier jour : Placer les cellules non transformées à une densité cellulaire de 20 à 25 % dans des plaques de culture appropriées et incuber toute la nuit à 37 °C, CO₂.

2) Définissez un gradient de concentration dans une plage appropriée en fonction du type de cellule, en sélectionnant au moins 6 concentrations (G418 est le plus actif contre les cellules en phase de division, les cellules doivent donc être cultivées pendant une période avant d'ajouter G418), par exemple, pour les cellules de mammifères, définissez 0, 50, 100, 200, 400, 800, 1000 μg/mL.

3) Deuxième jour : Retirez l’ancien milieu de culture et remplacez-le par un milieu fraîchement préparé contenant la concentration correspondante du médicament, avec trois répétitions pour chaque concentration.

4) Remplacer par un milieu frais contenant du médicament tous les 3 à 4 jours.

5) Effectuez des comptages de cellules vivantes à intervalles fixes (par exemple, tous les 2 jours) pour déterminer la concentration appropriée qui empêche la croissance des cellules non transfectées. Sélectionnez la concentration la plus faible qui peut tuer la majorité des cellules dans le nombre idéal de jours (généralement 7 à 10 jours) comme concentration de travail pour le criblage de lignées cellulaires transfectées stables.

3.3 Criblage des cellules transfectées stables

• La généticine G418 (60220ES) fournie par Yisheng Biotech a une efficacité ≥ 720 U/mg, une pureté d'environ 98 % et une stabilité des lots, avec un prix proche d'un tiers de celui des produits G418 des autres sociétés.
• Le milieu de dépistage contenant les médicaments a été remplacé tous les 3 à 4 jours.
• La formation de clones cellulaires (colonies) a été observée et évaluée après 7 jours de sélection. La formation de colonies peut prendre une semaine ou plus, selon le type de cellule hôte, la transfection et l'efficacité du criblage.
• 5 à 10 clones résistants ont été prélevés et transférés dans des plaques de culture cellulaire de 35 mm et maintenus dans un milieu de criblage contenant du médicament pendant 7 jours.
• Après avoir changé le milieu de culture normal.

4 Recommandation de produit

La généticine G418 (60220ES) fourni par Yeasen Biotech a une efficacité ≥ 720 U/mg, une pureté d'environ 98 % et une stabilité des lots, avec un prix près d'un tiers inférieur à celui des produits G418 des autres sociétés.

Spécification	S*	T*	Yeasen	Avantage Yeasen
Contenu (HPLC)	/	/	~98%	Haute pureté
Puissance (U/mg)	≥ 720 µg/mg	707-721 µg/mg	≥ 720 µg/mg	Haute efficacité
Prix ​​($/5 g)	~1000	~1000	~200	Bas prix

5 Cas expérimental

Chez E. coli, G69 et G99 étaient deux lots différents ; les concentrations de génomycine étaient respectivement de 8 mg/L, 12 mg/L et 16 mg/L, et la concentration minimale efficace était de 16 mg/L, ce qui inhibait complètement la croissance de diverses bactéries.