Cependant, la ligase d'ADN T4 est toujours confrontée à certains défis dans les applications pratiques, notamment une faible stabilité, une ligature adaptateur-adaptateur élevée ou un faible rendement de la bibliothèque d'ADN. Ces problèmes peuvent entraîner une efficacité expérimentale réduite, une diminution de la qualité des données, une mauvaise répétabilité des résultats expérimentaux et une faible pureté du produit, affectant ainsi l'efficacité globale des expériences de biologie moléculaire et la précision des données de séquençage. Pour résoudre ces problèmes, Yeasen, s'appuyant sur l'innovant ZymeEditor de sa filiale Molefuture^™ La plateforme d'évolution enzymatique a réalisé l'évolution enzymatique de l'ADN ligase T4.

Fig 1 Schéma du principe de réaction de l'ADN ligase T4^[1]

Fig. 2 Structure de l'ADN ligase T4

Outre la conception rationnelle, l'évolution dirigée de l'ADN ligase T4 a été réalisée avec la méthode MTPS en examinant la stabilité, l'activité et l'activité résiduelle. Et une bibliothèque de plus de 10⁴ Les mutants G1 ont été sélectionnés. Après une analyse approfondie des données de mutation, des candidats prometteurs ont été sélectionnés pour une purification et des tests rigoureux. Ensuite, tous les gagnants obtenus par conception rationnelle et évolution dirigée ont fait l'objet d'une caractérisation détaillée après une purification raffinée, englobant des évaluations de l'activité, de la stabilité, de l'auto-ligature de l'adaptateur, de l'auto-ligature des fragments d'ADN et du rendement en ADN. Sur la base des mutants G1, l'équipe Nous avons procédé à un mélange d'ADN et à une conception combinée de mutations dirigées pour obtenir des mutants exceptionnels qui répondent à diverses exigences d'application.

Du mutant au produit commercialisé grâce à plusieurs cycles de validation du séquençage

Le Éditeur Zyme^MT La plateforme d'évolution enzymatique a réussi à faire évoluer un mutant d'ADN ligase T4 avec une stabilité thermique élevée, un rendement de bibliothèque élevé et une faible auto-ligature de l'adaptateur grâce à la technologie d'évolution enzymatique. La T4 DNA Ligase actuellement améliorée a été lancée avec succès : Hieff® Versatile T4 DNA Ligase (600 U/μL) (Cat#12996ES). Ce produit surpasse l'ADN ligase T4 de type sauvage traditionnelle en termes d'efficacité de ligature et de stabilité thermique, et il a été vérifié par séquençage à haut débit, garantissant une excellente qualité.

Présentation des données

1. Stabilité thermique supérieure

Les mutants de l'ADN ligase T4 de Yeasen ont été soumis à un traitement thermique à 42℃ pendant 0, 2 et 4 heures, et ont été comparés aux ligases ADN T4 des fournisseurs Q, N, A et T.Par la suite, une bibliothèque d'ADN du génome entier a été construite en utilisant 1 µg d'ADN bovin fragmenté avec le kit de construction de bibliothèque d'ADN Yeasen (Cat#12927ES) pour comparer la stabilité thermique de la ligase d'ADN T4.

Fig 3 Test de stabilité thermique à 42℃

Résultats:

Stabilité thermique : Yeasen ≈ Fournisseur N ≈ Fournisseur A > Fournisseur T > Fournisseur Q.

2. Rendement de la bibliothèque plus élevé

Le mutant T4 DNA Ligase de Yeasen a été testé pour le rendement de la bibliothèque à des niveaux d'entrée d'ADN élevés et faibles, par rapport aux T4 DNA Ligases des fournisseurs Q, N, A et T. Le kit de construction de bibliothèque d'ADN Yeasen (Cat#12927ES) a été utilisé, avec 1 µg et 0,5 ng d'ADNg bovin fragmenté étant introduits pour construire des bibliothèques d'ADN.

Fig 4 Analyse du rendement de la bibliothèque d'ADN

Résultats:

Rendement de la bibliothèque (1 µg d'ADNg) : Yeasen > Fournisseur Q ≈ Fournisseur T ≈ Fournisseur A > Fournisseur N. Rendement de la bibliothèque (0,5 µg d'ADNg) : Yeasen ≈ Fournisseur Q ≈ Fournisseur A ≈ Fournisseur T > Fournisseur N.

3. Adaptateur inférieur auto-ligaturant

Le mutant T4 DNA Ligase de Yeasen a été comparé aux T4 DNA Ligases des fournisseurs Q, N, A et T pour l'auto-ligature de l'adaptateur. Le kit de construction de bibliothèque d'ADN Yeasen (Cat#12927ES) a été utilisé, avec 0 ng et 0,5 ng d'ADN bovin fragmenté comme entrée pour construire des bibliothèques d'ADN du génome entier.

Fig 5 Données d'auto-ligature de l'adaptateur avec une entrée d'ADNg de 0 ng (à gauche) et 0,5 ng (à droite)

Résultats:

1) Taux d'auto-ligature de l'adaptateur (0 ng gADN) : Fournisseur N > Yeasen > Fournisseur T > Fournisseur A > Fournisseur Q.

2) Taux d'auto-ligature de l'adaptateur (0,5 ng d'ADNg) : Yeasen > Fournisseur T > Fournisseur Q ≈ Fournisseur N > Fournisseur A.

Contactez-nous

Yeasen a surmonté avec succès les limites des ligases ADN T4 traditionnelles, en proposant un produit de ligase ADN T4 qui excelle en termes de stabilité thermique, de rendement de bibliothèque et d'auto-ligature de l'adaptateur. Au cours de ce processus, la société a accumulé une riche bibliothèque de mutants, offrant aux chercheurs une variété d'options pour répondre à différents besoins expérimentaux. Si vous êtes intéressé par nos produits ou par les mutants de ligases ADN T4, n'hésitez pas à nous contacter via les méthodes suivantes.

E-mail: order1@yeasen.com (NOUS)

Téléphone : +1 240-472-6069 (États-Unis)

De plus, Yeasen propose une gamme de produits de ligase ADN T4. Cliquez sur le lien du produit pour obtenir des informations sur le produit

Références

[1] Ligases Shuman S.ADN : progrès et perspectives[J].Journal de chimie biologique, 2009, 284(26):17365-17369.