La RNase HII, également connue sous le nom de RNase H2, est une endoribonucléase qui cible et rompt spécifiquement la liaison phosphodiester à l'extrémité 5' d'un ribonucléotide solitaire niché dans une hélice d'ADN double brin, produisant un groupe phosphate 5' et un groupe hydroxyle 3' (Fig 1). Cette enzyme présente une activité de clivage minimale envers l'ARN simple brin et est inactive à la fois contre l'ADN double brin (dsADN) et l'ADN simple brin (ssADN). Fonctionnellement active dans la plage de températures de 50°C à 75°C, la RNase HII atteint des performances maximales à des températures comprises entre 70°C et 75°C. Tirant parti de sa capacité unique à effectuer un clivage ciblé sur un seul site sur les sites d'ADN où un ribonucléotide est intégré, sans affecter l'ADN double brin ou l'ADN simple brin, la RNase HII sert de « déclencheur » de précision pour l'initiation de la réaction, y compris l'activation et l'extension de l'amorce, pour obtenir une amplification spécifique. Cette enzyme joue un rôle essentiel dans la PCR dépendante de la RNase H (rhPCR), la technologie d'amplification isotherme à médiation par boucle (LAMP) et la dégradation des composants de l'ARN dans les fragments d'Okazaki.

一. PCR dépendante de la RNase H(PCR en temps réel)
La rhPCR intègre la RNase HII et des amorces rhPCR fermées clivables spécialement conçues dans le processus de PCR. Cette approche exploite la propriété unique de la RNase HII d'hydrolyser sélectivement l'ARN dans les hybrides ADN-ARN, tout en laissant intactes les liaisons phosphodiester dans l'ADN et l'ARN simple brin ou double brin. Par conséquent, la RNase HII ne digère l'hybride ADN-ARN et permet l'extension de l'amorce que lorsque l'amorce est parfaitement complémentaire de la séquence d'ADN cible. Cette action ciblée améliore considérablement la précision de la réaction. La RNase HII est la seule enzyme capable d'initier l'élimination précise des ribonucléotides sans induire de mutations par clivage à l'extrémité 5' de l'acide ribonucléique. En raison de sa spécificité, de sa sensibilité et de sa reproductibilité élevées, la rhPCR offre des avantages distincts dans des applications telles que la détection de polymorphismes nucléotidiques simples (SNP), le typage génétique, la détection simultanée de cibles multiples et l'analyse environnementale des acides nucléiques.

Parcours Technique

1. Conception de l'amorce

La conception de l'amorce doit garantir que la température de fusion après la découpe est supérieure à la température de recuit pour garantir que l'amorce se lie de manière stable au modèle pendant les cycles de PCR. L'amorce rhPCR se compose de trois parties :

1) Segment d'ADN 5' : comparable en termes de longueur et de température de fusion (Tm) aux amorces PCR standard, il peut s'associer efficacement et s'étendre à partir de l'ADN modèle après avoir été coupé par l'enzyme RNase HII.

2) Une seule base d’ARN : fournissant un site de coupe pour la RNase HII.

3) Segment d'ADN 3' : une longueur de quatre ou cinq bases avec un bloqueur, généralement une molécule courte et non extensible telle que le propylène glycol, qui empêche l'extension de l'ADN polymérase jusqu'à ce que le bloqueur soit supprimé.

2. Coupe et extension

Au début de la réaction de rhPCR, l'amorce et l'ADN matrice sont libres. Lorsque l'amorce se lie à l'hétéroduplex ARN:ADN spécifique, la base ARN côté 5' de l'amorce bloquée est reconnue et coupée par l'enzyme RNase HII, laissant un oligonucléotide d'ADN avec un groupe 3'-hydroxyle, fournissant un point de départ pour l'extension de l'ADN polymérase. Ceci est suivi par le processus d'amplification PCR classique.

Fig 2. Schéma du principe de la rhPCR ^[1]

Oui.Amplification isotherme médiée par boucle (LAMP)

L'amplification isotherme médiée par boucle (LAMP) est une méthode simple et rapide d'amplification génique qui permet d'amplifier les acides nucléiques dans des conditions isothermes en peu de temps. Cependant, en raison de l'initiation de l'activité de l'ADN polymérase pendant la préparation à température ambiante, des mésappariements non spécifiques se forment, ce qui peut conduire à une petite quantité de mauvais appariements et de dimères d'amorces, provoquant des contaminations mineures pouvant entraîner des faux positifs.
L'application de la RNase HII au système d'amplification LAMP peut résoudre efficacement le problème des faux positifs dans la technologie LAMP, élargissant ainsi son application au diagnostic clinique. Comme le montre la figure 3, la méthode LAMP activée par amorce (PA-LAMP) utilisant la RNase HII, lorsque l'amorce s'associe à l'ADNss cible, l'enzyme RNase HII clive spécifiquement l'ARN sur l'amorce, l'activant et permettant l'extension de l'amorce, obtenant une amplification spécifique et réduisant efficacement les faux positifs dans le système.

YEASEN ARNase HII

RNase HII de YEASEN (Cat#14539) est dérivé de Pyrococcus abyssi, Pennsylvanie, et il est exempt de nucléases contaminantes, d'enzymes de coupure et de résidus d'ARNase, avec une faible contamination de l'ADN hôte, réduisant efficacement les faux positifs dans le système. L'ARNase HII de YEASEN est extrêmement résistante à la chaleur, conservant son activité même après 30 minutes à 95 °C, ce qui la rend compatible avec divers systèmes de réaction rhPCR et également adaptée à LAMP et à d'autres applications.

1. E. coli résidu d'ADN génomique < 0,5 copies/100 U

Détection de Escherichia coli Les résidus d'ADN génomique dans différents lots de RNase HII ont montré que le résidu d'ADN génomique de l'hôte de la RNase HII de YEASEN est bien inférieur à 0,5 copie/100 U.

Fig 4. Détection de Escherichia coli résidu d'ADN génomique

2. Test de résistance à la chaleur à 95°C

Après avoir chauffé la RNase HII à 95°C pendant 0 à 45 minutes, l'activité enzymatique de la RNase HII a été testée. Les résultats ont indiqué qu'il n'y avait presque aucune perte d'activité enzymatique dans la RNase HII de YEASEN même après 45 minutes de chauffage.

Fig 5. Test de résistance à la chaleur à 95°C

3. Pas d'exonucléase, d'enzyme de coupure ou de résidu d'ARNase (dose de 1 U)

En incubant 1 U de différents lots de RNase HII avec leurs substrats respectifs ADN/ARN à 37°C pendant 4 heures, les résultats de l'électrophorèse sur gel d'agarose ont indiqué qu'il n'y avait pas d'exonucléase, d'enzyme de coupure ou de résidu de RNase dans la RNase HII.

Fig. 6.Résultats de détection de l'exonucléase, de l'enzyme de coupure et du résidu d'ARNase

Produits connexes recommandés

Application du produit	Nom du produit	Numéro de catalogue
rhPCR, LAMPE	RNase HII (2 U/μL) RNase HII, sans glycérol (2 U/μL)	14539ES 14541ES
PCR en temps réel	ADN polymérase Hieff® Taq	10101ES
LAMPE RT	Hieff® ADN polymérase Bst Plus (40 U/μL)	14402ES
	Transcriptase inverse Hifair® III	11111ES

Références

[1] Dobosy JR, Rose SD, Beltz KR, Rupp SM, Powers KM, Behlke MA, Walder JA. PCR dépendante de la RNase H (rhPCR) : amélioration de la spécificité et de la détection du polymorphisme d'un seul nucléotide à l'aide d'amorces clivables bloquées. BMC Biotechnol. 10 août 2011 ; 11 : 80. doi : 10.1186/1472-6750-11-80.

[2] Du WF , Ge JH , Li JJ , et al. Détection en une seule étape et à haute spécificité d'une mutation d'un seul nucléotide par amplification isotherme médiée par une boucle activable par amorce (PA-LAMP) [J].Analytica chimica acta, 2019(1050-):1050.DOI:10.1016/j.aca.2018.10.068.