Figure 1. Schéma de la DNase I clivant l'ADN double brin en présence de Mg²⁺ et Mn²⁺

La DNase I commune est principalement purifiée à partir de pancréas bovin ou est une enzyme recombinante. Par rapport à la DNase I purifiée à partir de pancréas bovin, la DNase I recombinante présente des niveaux de RNase endogène relativement plus faibles ou peut être formulée sous forme de produits sans RNase, ce qui la rend plus adaptée aux applications sensibles à la RNase, telles que l'élimination de l'ADN des échantillons d'ARN.

Applications

En ce qui concerne les applications, la DNase I est bien connue pour son utilisation dans les expériences liées au maintien de l'intégrité de l'ARN, telles que l'extraction d'ARN exempt d'ADN, la préparation de modèles d'ARN sans ADNg avant la transcription inverse et la dégradation de modèles d'ADN après la transcription in vitro. De plus, elle peut être utilisée pour digérer des sondes d'ADN lors de l'élimination de l'ARNr, pour le marquage de l'ADN par translation de coupure, l'analyse des interactions ADN-protéine à l'aide de la méthode d'empreinte, la génération de bibliothèques d'ADN aléatoires, la réduction de la viscosité des lysats cellulaires ou des extraits de protéines, la digestion des adhérences cellulaires comme additif dans la culture cellulaire et le clivage partiel de l'ADN génomique comme contrôle positif dans les tests TUNEL pour la détection de l'apoptose. En résumé, la DNase I peut être utilisée dans presque toutes les applications nécessitant une digestion enzymatique de l'ADN. Ci-dessous, une brève introduction à plusieurs applications courantes sera fournie.

• Élimination de l'ADN génomique avant l'extraction de l'ARN ou la transcription inverse

L'ARN, en tant qu'échantillon couramment étudié dans les laboratoires, influence grandement la qualité des données expérimentales en raison de sa propre qualité. Il est généralement impossible d'éviter complètement le résidu d'ADNg pendant le processus d'extraction de l'ARN. Par conséquent, avant de procéder à des applications en aval difficiles (telles que l'analyse de l'expression de l'ARNm, l'analyse du transcriptome, etc.), il est généralement recommandé de traiter les échantillons d'ARN avec de la DNase I pour digérer l'ADNg résiduel. La digestion de l'ADNg peut être effectuée pendant l'extraction de l'ARN, après l'extraction de l'ARN ou avant la transcription inverse de l'ARN.

Figure 2. Procédé d'élimination de l'ADN génomique basé sur la DNase I

• Suppression de l'ADN matrice dans la transcription in vitro

La transcription in vitro (IVT) utilise principalement l'ADN comme modèle pour produire de l'ARN sous l'influence de substrats et de tampons appropriés. Les ARN polymérases couramment utilisées dans ce processus comprennent T7, T3 et SP6, qui sont responsables de la catalyse de la synthèse de l'ARN. Cependant, le produit d'ARN synthétisé peut contenir des résidus d'ADN, et l'élimination de ces résidus est bénéfique pour les expériences en aval.

En particulier dans le processus de développement des vaccins à ARNm, l’élimination de ces résidus d’ADN est une étape critique qui affecte directement la difficulté des processus de purification ultérieurs et la pureté du produit final.Pour éliminer efficacement l’ADN modèle, la DNase I est généralement utilisée pour le traitement afin de garantir que l’échantillon d’ARN est exempt de résidus d’ADN, une étape qui contribue à améliorer la précision et l’efficacité globales de l’expérience.

Figure 3 : Processus de transcription in vitro utilisant un plasmide linéarisé comme modèle^[4]

• Suppression de l'ARNr dans la construction et le séquençage de bibliothèques d'ARN

Dans les organismes, l'ARNr est très abondant et hautement conservé, ce qui n'a que peu d'importance pour obtenir des informations biologiques dans le cadre de recherches. Cependant, 95 % de l'ARN total extrait au cours des expériences est de l'ARNr humain, et la présence de ces ARNr peut interférer avec la détection des ARN cibles. Par conséquent, lors de la préparation et du séquençage de la bibliothèque d'ARN, l'ARNr est généralement éliminé en premier. Actuellement, la principale méthode d'élimination de l'ARNr est la digestion par l'ARNase, et sa principale méthode opérationnelle est la digestion par l'ARNase. les étapes et les principes sont les suivants :

1. Extraire l’ARN total ;
2. Hybrider des sondes d’ADN simple brin avec des molécules d’ARNr (Remarque : concevoir et synthétiser des sondes d’ADN simple brin spécifiques à l’ARNr) ;
3. La RNase H dégrade l’ARNr hybridé ;
4. La DNase I dégrade les sondes ADN ;
5. L'ARNr est éliminé avec succès, laissant derrière lui des modèles d'ARN non ARNr.

Figure 4 : Schéma du principe d'élimination de l'ARNr basé sur la méthode enzymatique^[5]

• Traduction de pseudonymes pour l'étiquetage de l'ADN

La traduction de Nick est la méthode la plus couramment utilisée pour marquer les sondes d'acide désoxyribonucléique en laboratoire. Cette méthode est obtenue grâce à l'action combinée de la DNase I et E.coli ADN polymérase I.

Le principe principal est le suivant :

1. Tout d’abord, utilisez une concentration appropriée de DNase I pour créer plusieurs entailles monocaténaires dans chaque brin de l’ADN double brin à marquer, formant des extrémités hydroxyles 3’ au niveau des sites d’entaille.
2. Ensuite, utilisez l'activité exonucléase 5'→3' de coliL'ADN polymérase I permet de retirer un nucléotide de l'extrémité 5' de l'entaille, tandis que l'activité polymérase 5'→3' de E. coli L'ADN polymérase I introduit un nucléotide marqué à l'extrémité 3' de l'entaille pour la réparer. Au fur et à mesure que l'entaille se déplace le long du brin d'ADN, les nucléotides marqués sont incorporés dans le brin d'ADN nouvellement synthétisé.

Figure 5 : Schéma du principe de marquage de l'ADN par translation de coupure^[6]

• Expérience d'analyse d'empreinte de DNase I

Le test d'empreinte de DNase I est une méthode précise permettant d'identifier les sites de liaison des protéines de liaison à l'ADN sur les molécules d'ADN. Le principe est que les protéines liées à un fragment d'ADN protègent la région liée contre la dégradation par la DNase I. Après digestion enzymatique, le fragment restant (l'« empreinte ») peut être utilisé pour déterminer sa séquence. Sur l'image du gel, il n'y a pas de bandes correspondant aux régions où la protéine est liée.

Le principe principal est le suivant :

1. Étiquetez les extrémités simple brin de la molécule d’ADN double brin à tester.
2. Mélangez la protéine avec l’ADN et ajoutez une quantité appropriée de DNase I pour la digestion enzymatique, formant des fragments d’ADN de différentes longueurs.La quantité d’enzyme doit être contrôlée pour garantir que les fragments d’ADN adjacents ne diffèrent que d’un seul nucléotide, et un contrôle sans protéine ajoutée doit être inclus en parallèle.
3. Retirez la protéine de l'ADN, séparez l'ADN dénaturé par électrophorèse PAGE et autoradiographiez pour interpréter la séquence nucléotidique de la région de l'empreinte par comparaison avec le groupe témoin.

Figure 6 : Schéma de principe du test d'empreinte de DNase I^[7]

Le ADNase I Guide de sélection de Yeasen

Pour répondre à divers besoins d'application, Yeasen propose recombinant ADNase I dans Escherichia coli, et peut fournir de la DNase I de qualité GMP pour répondre aux exigences de la transcription in vitro de l'ARNm et d'autres applications.

Positionnement du produit	Application	Nom du produit	numéro de catalogue
Sans RNase	élimination de l'ADN des préparations d'ARN et de protéines	DNase I recombinante (sans RNase)	10325ES
Qualité GMP, Sans RNase	Transcription in vitro de l'ARNm	UCF.ME® Désoxyribonucléase I (DNase I) de qualité GMP	10611ES

Références

[1] Ndiaye C, Mena M, Alemany L, et al. Détection de l'ADN du VPH, de l'ARNm E6/E7 et de p16INK4a dans les cancers de la tête et du cou : revue systématique et méta-analyse[J]. The Lancet Oncology, 2014, 15(12) : 1319-1331.

[2] Broccolo F, Fusetti L, Rosini S, et al. Comparaison de la charge virale d'ADN spécifique du type de VPH oncogène et de la détection d'ARNm E6/E7 dans les échantillons cervicaux : résultats d'une étude multicentrique[J]. Journal of medical virology, 2013, 85(3) : 472-482.

[3] Huang Z, Fasco MJ, Kaminsky L S. Optimisation de l'élimination de l'ADN contaminant de l'ARN par la Dnase I pour une utilisation dans l'ARN-PCR quantitative[J]. Biotechniques, 1996, 20(6) : 1012-1020.

[4] Kang DD, Li H, Dong Y. Progrès de l'ARNm transcrit in vitro (ARNm IVT) pour permettre la traduction dans les cliniques[J]. Advanced Drug Delivery Reviews, 2023, 199 : 114961.

[5] Wiame I, Remy S, Swennen R, et al. Inactivation thermique irréversible de la DNase I sans dégradation de l'ARN[J]. Biotechniques, 2000, 29(2) : 252-256.

[6] Adolph S, Hameister H. Traduction in situ des chromosomes métaphasiques par d-UTP[J marqué à la biotine]. Génétique humaine, 1985, 69 : 117-121.

[7] Song C, Zhang S, Huang H. Choisir une méthode appropriée pour l'identification des origines de réplication dans les génomes microbiens. Front Microbiol, 2015, 6: 1049.