Pngase F rapide, terminant la déglycosylation en seulement 10 minutes

Avec le développement rapide de la glycoprotéomique et de la recherche sur les médicaments à base d'anticorps, la modification de la glycosylation a également suscité beaucoup d'intérêt. Le contact entre cellules et cellules, et entre cellules et agents pathogènes, se fait principalement par l'interaction des sucres et des protéines, et la glycosylation détermine les propriétés d'adhésion des glycoconjugués. Dans l'IgG, la glycosylation N-liée conservée au niveau d'Asn297 dans la région Fc est également cruciale pour son activité. De plus, certains anticorps possèdent également des N-glycanes supplémentaires qui, avec le site conservé au niveau d'Asn297 dans la région Fc, affectent la reconnaissance, la demi-vie et la réponse immunitaire de l'anticorps.

La glycosylation des protéines est une modification post-traductionnelle complexe qui implique la connexion de chaînes glycaniques à des sites spécifiques sur les protéines. Selon le type de chaîne glycanique, les glycoprotéines sont divisées en glycoprotéines N-liées, glycoprotéines O-liées, etc. De plus, la glycosylation des protéines est également affectée par le type de cellule hôte et les conditions de fermentation (telles que le milieu de culture, la valeur du pH, la température, etc.). Par conséquent, les glycoprotéines présentent généralement une hétérogénéité dans les modèles de glycosylation, y compris les sites de glycosylation, les niveaux de glycosylation et la structure spécifique des chaînes glycaniques, ce qui rend le travail d'analyse et de caractérisation structurelle des chaînes glycaniques extrêmement difficile. Pour obtenir la quantité maximale d'informations structurelles sur les chaînes glycaniques, la principale stratégie d'analyse des chaînes glycaniques consiste à libérer d'abord les chaînes glycaniques des protéines, puis à effectuer une analyse et une caractérisation détaillées. Dans cette stratégie, une méthode de déglycosylation efficace, précise et stable est cruciale.

Les méthodes enzymatiques sont actuellement largement utilisées pour la déglycosylation.

Les glycoprotéines peuvent être classées en glycopeptides N-liés et O-liés en fonction de leurs types de chaînes glycaniques. Pour les glycopeptides N-liés, les enzymes couramment utilisées comprennent la peptide N-glycosidase F (PNGase F), l'endoglycosidase H (Endo H) et l'endoglycosidase S (Endo S). La PNGase F hydrolyse la liaison GlcNAc-Asn et peut éliminer les chaînes glycaniques à haute teneur en mannose, complexes et hybrides. L'Endo H coupe les liaisons glycosidiques au sein du noyau pentasaccharide de la chaîne N-glycanique. L'Endo S coupe spécifiquement les glycanes N-liés du noyau chitobiose de la chaîne lourde de l'IgG native.

Figure 1. Site de coupe de la PNGase F, Endo H et Endo S.

Parmi eux, la PNGase F est la méthode enzymatique la plus efficace pour éliminer presque tous les N-liés oligosaccharides dans les glycoprotéines, qui peuvent cliver les glycoprotéines oligosaccharidiques à haute teneur en mannose, hybrides et complexes reliées par l'asparagine, en éliminant spécifiquement les glycanes liés à N. Le site de clivage est : la liaison amide entre la N-acétylglucosamine (GlcNAc) la plus interne et le résidu d'asparagine, tout en convertissant l'asparagine sur la protéine après hydrolyse enzymatique en acide aspartique.

Lorsque le fucose α1-6 est situé au niveau du noyau de la GlcNAc, la PNGase F peut également couper ; ce n'est que lorsque le fucose α1-3 est situé au niveau du noyau de la GlcNAc (commun dans les glycoprotéines des plantes et des insectes) que la PNGase F ne peut pas couper.

Cependant, la réaction enzymatique PNGase F classique nécessite plusieurs heures pour libérer les N-glycanes de l'anticorps et, en raison de la préférence pour la libération des glycanes, une déglycosylation incomplète peut conduire à des résultats biaisés et la distribution des glycanes obtenue peut ne pas représenter la composition correcte des anticorps thérapeutiques. Par conséquent, l'obtention d'un profil précis de N-glycane le plus rapidement possible est cruciale pour la surveillance de la glycosylation pendant le processus de production d'anticorps et de protéines de fusion d'anticorps et d'autres agents biothérapeutiques.

PNGase F rapide

Fast PNGase F est un réactif recombinant optimisé qui peut déglycosyler rapidement et complètement les anticorps, les immunoglobulines, les protéines de fusion et d'autres glycoprotéines en quelques minutes. Cette enzyme peut éliminer rapidement et sans préférence tous les N-glycanes et peut être directement utilisée pour la chromatographie en aval ou l'analyse par spectrométrie de masse. Yeasen Fast PNGase F, N-glycosidase F (Fast Version) simplifie le processus expérimental, réduisant le temps expérimental tout en garantissant la sensibilité et la répétabilité.

Caractéristiques du produit :

Rapide: Déglycosylation complète et rapide en quelques minutes.

Haute pureté : Aucune contamination par protéase, glycosidase, pureté ≥ 95 %.

Non sélectif : Élimine rapidement et sans préférence tous les N-glycanes.

Bonne compatibilité : Utilisé directement pour la chromatographie en aval ou l'analyse par spectrométrie de masse.

Données de test :

Déglycosylation des protéines en une étape :

10 ug de substrat/100 ug d'anticorps et ddH2O mélangés jusqu'à un volume total de 16 uL ;
Ajouter 4 μL de tampon Fast PNGase F (5x), volume final 20 uL ;
Ajoutez 1 μL de Fast PNGase F.
Incuber à 50°C pendant 10 minutes.

Figure 2. Effet du clivage enzymatique en une étape sur le substrat protéique (A) et l'anticorps (B).

1 : Marqueur protéique Cat#20350ES) 2 : Concurrent + substrat ou anticorps 3 : Concurrent + substrat ou anticorps 4 : Yeasen Fast PNGase F 5 : Yeasen Fast PNGase F6 : Substrat ou anticorps 7 : Yeasen Fast PNGase F 8 : Concurrent

Déglycosylation des protéines en deux étapes :

10 ug de substrat/100 ug d'anticorps et ddH2O mélangés jusqu'à un volume total de 16 uL ;
Ajouter 4 μL de tampon Fast PNGase F (5x), volume final 20 uL ;
Incuber à 80°C pendant 2 minutes, laisser refroidir à température ambiante.
Ajoutez 1 μL de Fast PNGase F.
Incuber à 50°C pendant 10 minutes.

Figure 3. Effet de clivage enzymatique en deux étapes sur le substrat protéique (A) et l'anticorps (B).

Conclusion:

La Yeasen Fast PNGase F a une efficacité de clivage enzymatique identique ou supérieure à celle des concurrents importés dans les mêmes conditions de réaction ;
Il est recommandé d'effectuer un clivage enzymatique en deux étapes pour garantir une efficacité de clivage enzymatique plus élevée. Certains anticorps (tels que la Fab N-glycosylation) nécessitent une étape de préchauffage

pour une déglycosylation efficace.

De plus, Yeasen fournit également de la PNGase F régulière (Cat#20407ES, activité spécifique : 100 000 U/mL) et d'autres types de glycosidases, telles que l'Endo H glycosidase H (Cat#20414ES), l'Endo S glycosidase S (Cat#20413ES).

Guide d'achat

Numéro de produit	20406ES	20407ES	20414ES	20413ES
Nom du produit	Rapide PNGase F	PNGase F	Endo H	Endo S
Source	Expression recombinante de levure	Expression recombinante de levure	Expression recombinante de levure	E.coli expression recombinante
Activité spécifique	Non applicable	100000U/mL	1000000U/mL	8000 U/mg
Site de clivage	Presque tous les glycanes liés à N	Presque tous les glycanes liés à N	Glycanes à haute teneur en mannose liés à N	Clive la structure du disaccharide central de la chaîne lourde de l'IgG
Temps de digestion	10 minutes	1 à 3 heures	1 à 3 heures	1 h
Glycosylation	Approprié	Approprié	Approprié	Approprié
Structure des protéines	Approprié	Approprié	Approprié	Approprié

Informations sur la commande

Nom du produit	Numéro de produit	Spécification
PNGase F rapide (sans glycérol)	20406ES20/50	20 T/50 T
PNGase F	20407ES01/02	15000 U / 75000 U
Endo H	20414ES92/97	10000 U / 50000 U
Endo S	20413ES80/90	1000 U/5 x 1000 U

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