En ce qui concerne les télomères et la protélomérase En biologie, les gens pensent souvent d'abord au vieillissement, un phénomène naturel inévitable. Télomères est séquences d'ADN répétitives aux extrémités des chromosomes eucaryotes, qui portent la responsabilité de maintenir l’intégrité des chromosomes et de réguler le cycle de division cellulaire.
Protélomérase est une enzyme de synthèse de l'ADN par transcriptase inverse qui allonge les télomères. C'est une nucléoprotéine composée d'ARN et de protéines. Le composant protéique peut catalyser la synthèse de séquences répétées de télomères avec le composant ARN.
Figure 1. Mécanisme d'extension des télomères médiée par la protélomérase[1]
Protélomérase Les télomères peuvent réparer et allonger les télomères, compenser les défauts de réplication de l'ADN, prévenir la perte de télomères pendant la division cellulaire et augmenter le nombre de divisions cellulaires. En 2009, le prix Nobel de physiologie ou médecine a été décerné à Elizabeth H Blackburn, Carol W Greider et Jack W Szostak pour leurs contributions exceptionnelles à la révélation du rôle crucial des télomères et de la protélomérase dans la fonction cellulaire et le vieillissement.
Aujourd'hui, je souhaite vous présenter une protélomérase unique : la protélomérase TelN. provient du bactériophage N15 et est un composant du système de réplication N15, participant dans la génération d'ADN de prophage linéaire. Contrairement à la protélomérase Chez les eucaryotes, TelN est une enzyme protéique pure sans aucun composant ARN. Elle possède une ligature par clivage activité et laisse une extrémité fermée de manière covalente au site de clivage après avoir coupé l'ADN double brin (dsADN).
Figure 2. Protélomérase TelN Site de clivage
Protélomérase TelN Mécanisme d'action
Le site de reconnaissance de la protélomérase TelN est une séquence palindrome de 56 pb de long, avec telR et telL des deux côtés. La position centrale de la séquence cible est également une séquence palindrome telO. TelN Protélomérase se clive dans la séquence telO et forme une structure en épingle à cheveux fermée de manière covalente aux deux extrémités de clivage. L'extrémité de l'ADN après digestion est toujours composée de telR et telL, ce qui est connu sous le nom de os de chien ADN (dbADN).
Figure 3. Protélomérase mécanisme de clivage au site TelN[2]
En raison de l'activité de clivage-ligature enzymatique spéciale de la protélomérase TelN, l'ADN plasmidique circulaire peut être converti en molécules en forme d'haltère fermées de manière covalente linéaire par une réaction enzymatique en une seule étape. Par rapport aux molécules d'ADN ouvertes linéaires, l'ADN fermé linéaire présente un niveau d'expression protéique plus élevé dans les cellules, ce qui est très approprié pour la construction de mini ADN fermés linéaires avec une stabilité élevée et une séquence étrangère minimale. L'ADN plasmidique joue un rôle essentiel en tant qu'élément central du vaccin à ARNm, du vaccin à ADN et de la thérapie génique cellulaire. La méthode traditionnelle de production de plasmides implique la fermentation avec Escherichia coli et l'amplification en plusieurs étapes, et le risque incontrôlable dans le processus de fermentation limite le rendement de plasmides de haute qualité, ce qui devient la clé pour limiter la capacité de production de vaccins. La société Touchlight au Royaume-Uni a lancé une technologie innovante dbDNA. Cette technologie perturbe la méthode traditionnelle de fermentation bactérienne pour la préparation de l'ADN plasmidique et utilise à la place une synthèse enzymatique in vitro de l'ADN. L'activité spéciale de clivage-ligature enzymatique de la protélomérase TelN est également utilisée pour générer un mini ADN linéaire à extrémité fermée dans la méthode ci-dessus.
Application de la protélomérase TelN à la synthèse enzymatique de l'ADN
La méthode enzymatique in vitro de l'ADN basée sur l'ADN polymérase phi29 et la protélomérase TelN permet d'éviter de nombreux risques incontrôlables dans le processus de fermentation biologique, et la méthode enzymatique in vitro peut synthétiser l'ADN avec une vitesse rapide et un rendement élevé. L'ADN synthétisé peut être utilisé dans de nombreuses technologies émergentes, telles que les vaccins à ARNm, les vaccins à ADN, les vecteurs de thérapie génique et l'édition de gènes.
Figure 4. Organigramme de la synthèse enzymatique de l'ADN[3]
Processus de synthèse enzymatique de l'ADN
- Dénaturation du modèle
Le modèle d'ADN plasmidique circulaire est converti en deux ADN circulaires simple brin par un processus de dénaturation.
- Amplification du cercle roulant
L'amplification par cercle roulant a été réalisée en utilisant l'ADN polymérase Phi29 et l'ADN circulaire simple brin pour générer un long ADN concatémérique linéaire double brin avec des intervalles de séquence de reconnaissance de protélomérase.
- Coupure et fermeture covalente
La protélomérase TelN reconnaît le telRL sur l'ADN des complexes télomériques et effectue des activités de clivage-ligature pour générer des monomères d'ADN linéaires connectés de manière covalente.
- Élimination de l'ADN du squelette bactérien
Les endonucléases de restriction ou les exonucléases dégradent l'ADN du squelette bactérien avec une structure ouverte à l'extrémité pour obtenir de l'ADN contenant uniquement les éléments d'expression du gène cible. La synthèse enzymatique de la technologie de l'ADN contourne la fermentation biologique et peut rapidement réaliser une synthèse d'ADN plasmidique de niveau GMP, résolvant les limitations de capacité de production dans les domaines de la thérapie génique et des vaccins à ARNm. Elle recèle un énorme potentiel d'industrialisation. Pour promouvoir le développement de la technologie de synthèse enzymatique de l'ADN, YEASEN Biology peut fournir des matières enzymatiques de base pour la synthèse enzymatique de l'ADN, telles que l'ADN polymérase phi29 (14404ES) et la protélomérase TelN (14540ES), pour aider à la recherche et à la production de la technologie de synthèse enzymatique de l'ADN.
PPrésentation de la performance de YEASEN Protélomérase TelN
- Les performances de clivage-ligature sont excellentes, ce qui est équivalent aux marques importées.
En utilisant un plasmide superenroulé contenant le site de reconnaissance de la protélomérase TelN comme modèle, l'enzyme d'addition de gradient (0,078-5 U) de YEASEN et de la marque A a été ajoutée. 0,5 μg de plasmide superenroulé a été converti en ADN double brin linéaire fermé (dsADN). L'électrophorèse sur gel a été utilisée pour détecter l'efficacité de la conversion, et les résultats ont montré que l'activité de clivage et de ligature de la protélomérase TelN de YEASEN était équivalente à celle de la marque A.
Figure 5. Détection de l'activité de clivage de la protélomérase du marqueur TelN M:, C : contrôle du plasmide surenroulé
- L'intégrité de la fermeture de l'ADNdb linéaire > 90 %
En utilisant le plasmide superenroulé contenant le site de reconnaissance de la protélomérase TelN comme modèle, en ajoutant la protélomérase TelN de YEASEN et de la marque A, en convertissant 0,5 μg de plasmide superenroulé en ADN double brin linéaire fermé et en ajoutant l'exonucléase T5 pour détecter son intégrité terminale grâce au degré de dégradation de la bande. Les résultats ont montré que l'intégrité de la fermeture terminale de l'ADN double brin générée par la protélomérase TleN de YEASEN était > 90 %, ce qui était équivalent à celle de la marque A.
Figure 6. Test d'intégrité de la fermeture de l'extrémité de la protélomérase TelN. C1 : plasmide contenant le site de reconnaissance TelN, sans protélomérase TelN ; C2 : plasmide contenant le site de reconnaissance TelN, la protélomérase TelN, sans exonucléase T5 ; Plasmide : plasmide contenant le site de reconnaissance TelN.
Produits connexes de Synthèse enzymatique de l'ADN
| Classification des produits | Nom du produit | Numéro de catalogue |
| Protélomérase | 14540ES | |
| ADN polymérase Phi29 | 14404ES | |
| Exonucléase | Exonucléase III | 14525ES |
| 14538ES | ||
| dNTP | 10125ES |
RRéférences
[1] Giardini MA, Segatto M, da Silva MS, Nunes VS, Cano MI. Télomère et protélomérase biologie. Prog Mol Biol Transl Sci. 2014;125:1-40.
[2] Heinrich J, Schultz J, Bosse M, Ziegelin G, Lanka E, Moelling K. Le mini ADN fermé linéaire généré par l'enzyme de clivage-jonction procaryote TelN est fonctionnel dans les cellules de mammifères. J Mol Med (Berl). 2002;80(10):648-654.
[3] Heinrich J, Schultz J, Bosse M, Ziegelin G, Lanka E, Moelling K. Le mini ADN fermé linéaire généré par l'enzyme de clivage-jonction procaryote TelN est fonctionnel dans les cellules de mammifères. J Mol Med (Berl). 2002;80(10):648-654. doi:10.1007/s00109-002-0362-2.