La technologie d'amplification isotherme permet d'amplifier des séquences d'acides nucléiques spécifiques dans des conditions de température constante. En raison des caractéristiques de l'absence d'équipement spécial, du temps d'amplification court et de la sensibilité élevée, elle a montré de bonnes perspectives d'application dans la détection sur site et le diagnostic au point de service et est très adaptée au développement d'outils de diagnostic moléculaire.

Dans le contexte de la pandémie du nouveau coronavirus avec l'augmentation des souches et de l'infectiosité, la technologie d'amplification isotherme peut détecter le nouveau coronavirus rapidement avec des instruments simples, contribuant à résoudre le problème selon lequel certains patients atteints de COVID-19 ne peuvent pas être rapidement confirmés en raison du long temps de détection et des exigences élevées en matière d'équipements de détection et de réactifs des techniques PCR traditionnelles. Alors, quel est le principe de la RT-LAMP, l'une des techniques d'amplification isotherme ? Quelles sont les matières premières de haute qualité que Yeasen peut fournir ?

1. Quel est le principe de RT-LAMP ?
2. Conception de l'amorce pour RT-LAMP
3. Quelles matières premières Yeasen peut-il fournir ?
4. Guide de sélection des produits

1. Quel est le principe de RT-LAMP ?

En 2000, les chercheurs japonais Notomi et d'autres ont mis au point une nouvelle technologie d'amplification des acides nucléiques appelée amplification isotherme à médiation par boucle (LAMP). LAMP utilise 4 amorces spécifiques conçues pour 6 régions du gène cible et utilise l'ADN polymérase à déplacement de brin pour amplifier 109 copies de la séquence cible en quelques dizaines de minutes dans des conditions isothermes (60 à 65 ℃). Les résultats ont été jugés par électrophorèse sur gel d'agarose et les résultats positifs ont montré des bandes en forme d'échelle. LAMP présente les caractéristiques d'une forte spécificité, d'une sensibilité élevée, d'un fonctionnement rapide et simple et d'un faible coût. Grâce à l'amélioration et au perfectionnement continus de cette technologie, elle est actuellement utilisée dans la détection de divers micro-organismes pathogènes.

La RT-LAMP est une méthode dans laquelle la transcriptase inverse est ajoutée au système d'amplification LAMP, ce qui permet de réaliser la détection directe de l'ARN viral. L'efficacité d'amplification de LAMP est extrêmement élevée, de sorte qu'une grande quantité d'acide nucléique peut être amplifiée avec seulement une petite quantité d'ADNc. Le temps de transcription inverse dans le processus d'amplification de l'acide nucléique est économisé et la vitesse de détection de l'ARN est accélérée.

L'ADN est dans un état d'équilibre dynamique à environ 65 ℃. Sous l'action de l'ADN polymérase à déplacement de brin, à partir de l'extrémité 3' du segment F2 de l'amorce FIP, il est associé à la séquence complémentaire de l'ADN matrice pour initier la synthèse de l'ADN par déplacement de brin. L'amorce F3 est complémentaire de F3c à l'extrémité avant de F2c et prend l'extrémité 3' comme point de départ pour synthétiser son ADN tout en remplaçant le brin d'ADN synthétisé par l'amorce FIP principale par l'action d'une ADN polymérase à déplacement de brin. Prolongez vers l'avant. Le brin d'ADN synthétisé par l'amorce F3 finale forme un double brin avec un brin d'ADN matrice. Le brin d'ADN synthétisé par l'amorce FIP est remplacé par le brin d'amorce F3 pour générer un brin simple. Ce brin simple a des segments F1c et F1 complémentaires à l'extrémité 5', de sorte qu'un appariement d'auto-bases est effectué pour former une structure circulaire. Et l'amorce BIP est hybridée et combinée avec le brin simple, et l'extrémité 3' de l'amorce BIP est utilisée comme point de départ pour synthétiser un brin complémentaire, et la structure est ouverte dans le processus.Ensuite, des amorces similaires à F3 et B3 sont insérées à partir de l'amorce BIP, un appariement complémentaire des bases est effectué et un nouveau brin complémentaire est synthétisé à partir de l'extrémité 3' comme point de départ. Il y a des séquences complémentaires aux deux extrémités de l'ADN monocaténaire remplacé, et un appariement des bases se produit pour former une structure circulaire, de sorte que la chaîne entière présente une structure en forme d'haltère. Cette structure est la structure de départ du cycle d'amplification de la méthode RT-LAMP.

Dans la structure en forme d'haltère, l'extension de l'ADN est réalisée en utilisant le segment F1 à l'extrémité 3' comme point de départ et en s'utilisant lui-même comme modèle. Et l'amorce FIP F2 s'hybride avec le F2c monocaténaire sur la boucle pour initier un nouveau cycle de réaction de déplacement de brin. L'acide nucléique double brin synthétisé à partir du segment F1 est dissocié et, de la même manière, une structure circulaire se forme sur l'acide nucléique. Il existe une forme monocaténaire de B2c sur la structure circulaire, et B2 sur l'amorce BIP s'hybride avec elle pour initier un nouveau cycle d'amplification, et une structure circulaire se forme par le même processus. Selon ce processus, les séquences complémentaires sur le même brin passent par l'appariement, l'extension de brin et forment finalement des structures de différentes tailles.

2. Conception de l'amorce pour RT-LAMP

La conception de l'amorce est la clé de l'amplification et de la détection réussies de RT-LAMP. Les amorces RT-LAMP comprennent deux amorces externes (F3 et B3) et deux amorces internes (FIP et BIP). Amorce F3 : L'amorce externe en amont, constituée de la région F3, est complémentaire de la région F3c du gène cible. Amorce FIP : amorce interne en amont, constituée de la région F2, la région F2c à l'extrémité 3' du gène cible dans la région F2 est complémentaire de la région F1c à l'extrémité 5' du gène cible. Amorce BIP : amorce interne en aval, composée de la région B2, la région B2 est complémentaire de la région B2c à l'extrémité 3' du gène cible et a la même séquence que la région B1c à l'extrémité 5' du gène cible.

De la même manière que pour la PCR, les principes de conception des amorces doivent tenir compte de facteurs tels que la composition de base, la teneur en GC et la sous-structure. De plus, les points suivants doivent être pris en compte. Les extrémités 5' des amorces internes FIP et BIP, c'est-à-dire F1c et B1c, ont généralement une longueur de 8 à 50 pb. La longueur est de préférence de 15 à 25 pb, et la valeur Tm est supérieure aux valeurs Tm de F2 et B2 à l'extrémité 3'. Les extrémités 3' des amorces internes FIP et BIP, c'est-à-dire F2 et B2, ont généralement une longueur de 8 à 50 pb. La longueur est de préférence de 15 à 25 pb, et la valeur Tm est cohérente avec la température optimale de l'ADN polymérase Bst sélectionnée dans l'expérience. Les longueurs des amorces externes F3 et B3 ont généralement une longueur de 8 à 50 pb. La longueur est de préférence de 15 à 25 pb, et sa valeur Tm est inférieure à celle de F2 et B2. Lors de la conception des amorces, la structure de la boucle et la taille de la séquence cible doivent être prises en compte. Lorsque le nombre de bases dans la boucle est supérieur à 40 pb et que la taille de la séquence cible est de 130 à 200 pb, l'efficacité d'amplification est la plus élevée.

3. Quelles matières premières Yeasen peut-il fournir ?

3.1 [Nouvelle mise à niveau] Yeasen Bst Plus d'ADN polymérase

Le nouveau mis à niveau ADN polymérase Hieff™ Bst Plus (Cat#14402ES, 14403ES) est obtenu en exprimant et en purifiant le gène de l'ADN polymérase de Bacillus stearothermophilus p manquant du domaine exonucléase 5′→3′ dans E.coli.La capacité de déplacement du brin enzymatique est forte et présente les avantages d'une sensibilité élevée, d'une efficacité d'amplification élevée et d'une tolérance élevée au dUTP, et peut être largement utilisée dans la détection en temps réel d'agents pathogènes basée sur la technologie d'amplification isotherme.

3.1.1 Rapide et haute sensibilité

L'ADN polymérase Yeasen Hieff™ Bst Plus présente une sensibilité élevée et peut détecter le gène cible à partir de 5 copies seulement. La quantité de matrice est de l'ordre du femtogramme (fg) et le taux d'amplification est plus rapide que celui des produits concurrents.

Figure 1. La réaction RT-LAMP a été réalisée avec Yeasen L'ADN polymérase Hieff™ Bst Plus (orange) et les enzymes Bst du concurrent N (gris) et du concurrent T (bleu) pour amplifier le SARS-CoV-2. Les résultats montrent que l'ADN polymérase Yeasen Hieff™ Bst Plus peut toujours atteindre le seuil plus rapidement que les produits concurrents, et le taux d'amplification est plus rapide.

4. Guide de sélection des produits

Les produits fournis par Yeasen sont les suivants :

Tableau 1.Informations sur le produit