L'anticorps ADN polymérase anti-TAQ double bloc pour aider à réduire l'amplification non spécifique

Le diagnostic moléculaire est le sous-domaine qui se développe le plus rapidement dans le domaine du diagnostic in vitro. Il présente les avantages d'un temps de détection court, d'une sensibilité élevée et d'une forte spécificité. Il est largement utilisé dans le diagnostic concomitant des tumeurs et le dépistage des maladies infectieuses et génétiques. Dans le domaine du diagnostic moléculaire, la PCR n'est pas seulement la plate-forme technologique la plus mature avec la plus grande part de marché, mais aussi la technologie « de référence » du diagnostic clinique. Dans la réaction PCR traditionnelle, le problème de l'amplification non spécifique se pose souvent. L'amplification non spécifique affecte directement l'interprétation des résultats de détection et entraînera une baisse de la sensibilité de l'amplification et même du rendement des fragments cibles. Comment se produit l'amplification non spécifique et comment peut-elle être efficacement évitée ?

1. L'ADN polymérase conventionnelle peut conduire à une amplification non spécifique

2. La polymérase à démarrage à chaud peut améliorer la spécificité de l'amplification

3. L'anticorps Taq à double bloc peut doubler la spécificité et la stabilité de l'amplification

4. Présentation des performances du Taq à double bloc de Yeasen anticorps

5. Informations sur le produit

1. L'ADN polymérase conventionnelle peut conduire à une amplification non spécifique

La faible spécificité de séquence des amorces est la cause directe de l'amplification non spécifique. En tant que promoteur de l'ADN polymérase classique, son activité exonucléase peut tronquer la séquence de l'amorce d'ADN lors de la préparation du système PCR, réduisant ainsi la spécificité des amorces.

De plus, l'ADN polymérase classique a non seulement une activité exonucléase mais aussi une activité polymérase. Bien que la température d'extension optimale de l'ADN polymérase soit de 72 °C, la polymérase est toujours active à température ambiante. Par conséquent, lors de la préparation de la réaction PCR et du processus de chauffage initial, les amorces peuvent former une liaison non spécifique avec certains modèles monocaténaires et s'étendre sous l'action de l'ADN polymérase Taq, ce qui entraîne l'amplification de séquences non ciblées et affecte la spécificité de la réaction.

Par conséquent, les systèmes PCR sont souvent configurés sur glace pour inhiber l'activité de l'ADN polymérase. Bien que cette méthode soit simple et peu coûteuse, elle ne peut pas inhiber complètement l'activité enzymatique et ne peut donc pas éliminer l'amplification de produits non spécifiques.

2. La polymérase à démarrage à chaud peut améliorer la spécificité de l'amplification

La polymérase à démarrage à chaud est le composant principal de la PCR à démarrage à chaud. À température ambiante, le site actif de l'ADN polymérase est bloqué par un modificateur d'enzyme. Ce n'est qu'après la dénaturation de la PCR à 95 ℃ que le modificateur d'enzyme tombe et que l'activité enzymatique démarre, évitant ainsi l'amplification non spécifique provoquée par l'enzyme.

Actuellement, les méthodes de modification par démarrage à chaud de l'ADN polymérase couramment utilisées sur le marché comprennent principalement une méthode chimique, une méthode par ligand et une méthode par anticorps. Parmi elles, l'effet de blocage de la polymérase à démarrage à chaud modifiée par anticorps est le meilleur et la vitesse de libération de l'activité enzymatique est rapide, ce qui peut réduire considérablement le temps de réaction de la PCR. Il s'agit d'une méthode de modification enzymatique à démarrage à chaud largement utilisée sur le marché des dispositifs de diagnostic in vitro.

Cependant, il convient de noter que la méthode traditionnelle de démarrage à chaud des anticorps bloque uniquement l'activité polymérase 5'→3' de l'ADN polymérase Taq, ce qui ne peut empêcher l'amplification non spécifique causée par une mésappariement ou un dimère d'amorce qu'à basse température.Cependant, comme mentionné ci-dessus, l'ADN polymérase Taq possède non seulement une activité polymérase 5'→3' mais aussi une activité exonucléase 5'→3'. Cette activité exonucléase peut conduire à la dégradation de sondes dépareillées ou d'autres matériaux à basse température, ce qui entraîne des signaux non spécifiques.

3. L'anticorps Taq à double bloc peut doubler la spécificité et la stabilité de l'amplification

En tant que leader innovant dans l'industrie nationale des enzymes moléculaires, Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd. (ci-après dénommée Yeasen) se concentre sur la R&D et la production de matières premières d'enzymes moléculaires et ose innover. S'appuyant sur sa propre plateforme de criblage d'anticorps mature, elle crible l'anticorps bloquant avec l'ADN polymérase Taq comme molécule cible. Après des années de recherche minutieuse et d'optimisation du système, elle a développé l'anticorps anti-ADN polymérase Taq à double blocIl peut non seulement bloquer l'activité polymérase de l'ADN polymérase Taq, mais également bloquer l'activité exonucléase de l'ADN polymérase Taq. Dans une approche à deux volets, il peut non seulement empêcher efficacement l'amplification non spécifique causée par une mauvaise correspondance ou un dimère d'amorce, mais également empêcher la dégradation du matériau de générer des signaux non spécifiques et améliorer doublement la stabilité du réactif.

4. Présentation des performances du Taq à double bloc de Yeasen anticorps

4.1 L'utilisation d'anticorps Taq à double bloc est précise et plus sensible

Après avoir bloqué la Taq polymérase avec l'anticorps double-bloc de Yeasen et l'anticorps de la société T, les échantillons positifs ont été détectés par ARMS-PCR.

Figure 1. Courbe d’amplification ARMS-PCR ; Bleu : anticorps bloquant de la société T ; Rouge : anticorps à double blocage de Yeasen

On peut voir sur la figure 1 que la Taq polymérase bloquée par l'anticorps double bloc de Yeasen présente un typage précis et une sensibilité plus élevée dans l'amplification ARMS-PCR.

4.2 L'anticorps Taq à double bloc est efficace Blocage de l'activité exonucléase de l'ADN polymérase Taq

Les sondes d'amorce synthétisées ont été mises en correspondance avec la solution de réaction de l'ADN polymérase Taq bloquée respectivement par des anticorps non fermés et doublement bloqués et mises à réagir à 40 ℃ pour détecter leurs signaux de fluorescence.

Figure 2. Détection de l’efficacité de blocage de l’anticorps double-bloc pour l’activité exonucléase ; Jaune : groupe ADN polymérase Taq non fermé ; Violet : groupe d'ADN polymérase Taq bloqué par un anticorps double-bloc

On peut le voir sur la figure 2 que l'anticorps à double blocage peut bloquer efficacement l'activité exonucléase de l'ADN polymérase Taq.

4.3 L'anticorps Taq à double bloc peut améliorer efficacement la stabilité du réactif de détection

L'ADN polymérase Taq a été bloquée avec un anticorps bloquant traditionnel et un anticorps à double blocage respectivement et configurée dans un prémélange complet contenant une sonde d'amorce. 10 000 copies du plasmide ASF ont été amplifiées à 4 ℃ pendant 10 jours ou à 37 ℃ pendant 1, 3 et 5 jours. La courbe d'amplification et les changements de valeur Ct ont été observés, et les effets de l'anticorps bloquant traditionnel et de l'anticorps à double blocage sur la stabilité de la solution de réaction de prémélange complet ont été comparés.

Figure 3.Courbe d'amplification de 10 000 copies de plasmide ASF amplifié par une solution de réaction de blocage d'anticorps bloquant traditionnel (a) et d'anticorps double blocage (b) ; Bleu : conserver à 4℃ pendant 10 jours ; Rouge : placé à 4℃ pendant 0 jour (témoin)

Il ressort de la figure 3 que l'anticorps à double blocage peut maintenir la stabilité de la solution de réaction et améliorer efficacement la stabilité du réactif de détection par rapport à l'anticorps de blocage traditionnel. La courbe d'amplification et la valeur Ct n'ont pas changé de manière significative après que l'ensemble du prémélange contenant la sonde d'amorce a été bloqué par un anticorps à double blocage et placé à 4 °C pendant 10 jours.

Figure 4. Courbe d'amplification de 10 000 copies du plasmide ASF amplifié par une solution de réaction de blocage d'anticorps bloquant traditionnel (a) et d'anticorps double-bloc (b) ; Bleu : conserver à 37℃ pendant 5 jours ; Vert : 37℃ pendant 3 jours ; Jaune : 37℃ pendant 1 jour ; Rouge : placé à 37℃ pendant 0 jours (témoin)

La figure 4 montre que l'anticorps à double blocage peut maintenir la stabilité de la solution de réaction et améliorer efficacement la stabilité du réactif de détection par rapport à l'anticorps de blocage traditionnel. L'anticorps à double blocage bloque l'ensemble du prémélange contenant l'amorce-sonde, et la différence de valeur Ct est inférieure à 0,2 après avoir été placé à 37 °C pendant 1, 3 et 5 jours.

4.4 Les anticorps Taq à double bloc aident à résoudre le problème de la dérive de la ligne de base

Lorsque certaines amorces coopèrent avec un tampon et des instruments spécifiques, il y aura une dérive de la ligne de base. Yeasen a essayé de nombreuses méthodes pour améliorer le problème de la ligne de base et a découvert que l'anticorps à double bloc était plus propice à une ligne de base stable.

Figure 5. Courbe d’amplification du gène N (a) et du gène ACT (b) ; Rouge : anticorps bloquant traditionnel ; Vert : anticorps à double bloc

Comme le montre la figure 5, l’utilisation d’anticorps à double bloc sous des amorces et des tampons spécifiques peut aider à résoudre le problème de la dérive de la ligne de base.

4.5 Une bonne linéarité a été obtenue en utilisant un anticorps Taq à double bloc

100 000, 10 000, 1 000 et 100 copies de plasmides doubles ASF/ACT ont été amplifiées avec la solution de réaction bloquée par un anticorps double bloc, et la courbe standard a été réalisée.

Figure 6. Courbes standard du gène ASF (a) et du gène ACT (b) produites par une solution de réaction à double bloc

Comme on peut le voir sur la figure 6, la courbe standard R2 du gène ASF est de 0,998 et l'efficacité d'amplification est de 98,848 % ; la courbe standard R2 du gène ACT était de 0,998 et l'efficacité d'amplification était de 98,113 %.

4.6 Taq à double bloc L'anticorps peut libérer rapidement une activité enzymatique

La polymérase Taq a été bloquée avec l'anticorps importé de la société T et Anticorps à double blocage de Yeasen (cat#31303) respectivement, et l'activité enzymatique a été détectée après un choc thermique à 95 ℃ pendant 20 s. On peut voir que le 31303 peut libérer plus de 95 % de l'activité enzymatique après un choc thermique à 95 ℃ pendant 20 s, ce qui est équivalent à l'anticorps de la société T.

Tableau 1. Activité enzymatique

4.7 Taq à double bloc Anticorps Peut bloquer de nombreux types d'enzymes Taq

Trois types d'enzymes Taq (type sauvage et 2 mutants) ont été bloqués par l'anticorps double-bloc de Yeasen (cat#31303), et le rapport de blocage était de 1 μ g: 5 U, mesurant la valeur de fluorescence et l'efficacité de scellement. On peut voir que l'effet de blocage de l'anticorps double-bloc de Yeasen (cat#31303) est meilleur pour différents types d'enzymes Taq.

Tableau 2. Efficacité de blocage de différents types d'enzymes Taq

4.8 Yeasen L'anticorps Taq à double bloc ne présentait aucun résidu génomique chez la souris

En prenant l'eau comme modèle pour le contrôle négatif et le génome de souris comme modèle pour le contrôle positif, 31 303 lots différents ont été amplifiés. Il a été constaté que le fragment cible n'était pas amplifié dans l'échantillon, ce qui indique qu'il n'y avait aucun résidu de génome de souris dans l'anticorps.

Figure 7. Diagramme de détection des résidus du génome de la souris

Remarque : - est le contrôle négatif, + est un contrôle positif et 1 à 5 sont 31 303 échantillons de différents lots

5. Informations sur le produit