dNTP signifie ribonucléotide triphosphate à motifs utilisé en PCR, capable d'amplifier un brin d'ADN en croissance. En d'autres termes, les dNTP en PCR se lient aux brins d'ADN complémentaires par le biais de liaisons hydrogène, et les brins d'ADN en croissance sont étendus à l'aide de l'ADN polymérase Taq. Quelle est l'application spécifique des dNTP en PCR ? Quelles sont les propriétés que doivent posséder les dNTP de haute pureté ?

1. Que sont les dNTP ?
2. Quelle est la concentration de dNTP dans la PCR ?
3. Quelles sont les propriétés requises pour un dNTP de haute pureté ?
4. Produits associés et performances

1. Que sont les dNTP ?

Les désoxynucléosides triphosphates (dNTP) sont des nucléosides triphosphates contenant du désoxyribose, une chaîne de nucléotides composée de ribose, d'une base et d'un phosphate. Les dNTP sont les éléments constitutifs essentiels des molécules d'acide nucléique et sont donc des composants nécessaires des mélanges PCR car aucun nouvel ADN amplifié ne pourrait être généré sans eux. Les quatre désoxynucléotides individuels qui composent une séquence d'ADN comprennent le désoxyadénosine triphosphate (dATP), le désoxythymidine triphosphate (dTTP), le désoxycytidine triphosphate (dCTP) et le désoxyguanosine triphosphate (dGTP). En outre, la qualité des dNTP est également essentielle au succès de nombreuses procédures telles que la PCR, la synthèse d'ADNc, la qPCR, le séquençage, le clonage et le marquage de l'ADN.

Il existe quatre types de dNTP, ou désoxynucléotide triphosphate, chacun utilisant une base d'ADN différente : l'adénine (dATP), la cytosine (dCTP), la guanine (dGTP) et la thymine (dTTP). L'utilisation de dNTP pendant la phase d'extension fournit des bases simples prêtes à entrer dans l'ADN et à le doubler, comme des blocs de construction. Le but de cette technique étant de synthétiser un nouvel ADN, le dNTP fournit des nucléotides au brin « décompressé » en utilisant le modèle d'un seul côté. Cela transforme un seul brin d'ADN en deux et peut continuer de manière exponentielle tant que les réactifs restent présents jusqu'à l'étape de maintien final.

2. Quelle est la concentration de dNTP dans la PCR ?

La PCR est une technique in vitro de synthèse d'ADN qui permet de générer plusieurs copies d'un fragment d'ADN d'intérêt afin de pouvoir le visualiser par électrophorèse sur gel. Le but de la PCR est de réaliser un grand nombre de copies d'ADN pour diverses applications en aval dans le séquençage de l'ADN ou les puces à ADN. Ses composants comprennent des matrices d'ADN, des amorces, des tampons et l'ADN polymérase Taq dNTP. Pour comprendre le mécanisme de la PCR, il est nécessaire de comprendre l'importance et le principe des composants utilisés. Le dNTP est l'un des composants clés de la PCR. La fonction des dNTP dans la PCR est d'amplifier le brin d'ADN en croissance à l'aide de l'ADN polymérase Taq et de se combiner avec le brin d'ADN complémentaire par liaison hydrogène.

Le processus de PCR est divisé en trois étapes dépendantes de la température : dénaturation, recuit et extension. Au cours de l'étape de dénaturation, l'ADN double brin est dénaturé en ADN simple brin. Au cours de l'étape de recuit, les amorces se lient à l'emplacement exact de leur séquence complémentaire et, au cours de l'étape d'extension, la Taq ADN polymérase ajoute des dNTP au brin d'ADN en croissance. Une fois les brins ouverts et les amorces liées à l'ADN simple brin, la Taq ADN polymérase commence son activité catalytique. À l'étape suivante, l'ajout de dNTP commence, qui se lie au complexe P-ADN avec moins d'affinité si le nucléotide complémentaire exact est présent. Peu de temps après que la Taq ADN polymérase se soit arrêtée, des interactions de liaison hydrogène entre les bases complémentaires et les dNTP se produisent. Ici, ce n'est pas le nucléotide entier au début, mais la base (base azotée) sur le dNTP qui décide de se lier ou non.Premièrement, si elle trouve une base complémentaire (A pour T, G pour C) sur le modèle ssADN, elle formera une liaison hydrogène entre elles. Trois liaisons hydrogène entre C et G et deux liaisons hydrogène entre A et T sont créées. Une fois la liaison hydrogène formée, l'ADN polymérase Taq se conforme à l'incorporation du dNTP dans le brin d'ADN en croissance en formant une liaison phosphodiester. Maintenant, une fois la liaison phosphodiester formée, l'ADN polymérase Taq va plus loin en ajoutant de nouveaux dNTP. Une liaison phosphodiester est formée entre le 3'OH de l'amorce et le 5'P du dNTP. Après la liaison hydrogène, l'ADN polymérase Taq catalyse la réaction en éliminant les gamma et bêta-phosphates des triphosphates des dNTP. Une fois la réaction terminée, deux pyrophosphates (PPi) sont libérés. Mais la cinétique exacte de l'interaction des dNTP et de la Taq polymérase dans les réactions de PCR reste inconnue.

Ces quatre nucléotides sont généralement ajoutés à la réaction de PCR en quantités équimolaires pour une incorporation optimale des bases. Cependant, dans certaines situations telles que la mutagenèse aléatoire par PCR, des concentrations déséquilibrées de dNTP sont intentionnellement fournies pour favoriser un degré plus élevé d'incorporation erronée par une ADN polymérase non correctrice. Le facteur qui détermine la concentration minimale de dNTP est la longueur de l'ADN et la composition de la séquence cible. Dans la réaction de PCR, le dNTP est généralement de 50 à 200 μmol/L. Lorsque la concentration finale de dNTP est supérieure à 50 mmol/L, elle peut inhiber l'activité de l'ADN polymérase Taq. Les concentrations des quatre dNTP doivent être égales pour réduire l'incorporation erronée pendant l'amplification en raison de l'absence d'un dNTP.

Dans les applications PCR courantes, la concentration finale recommandée de chaque dNTP est généralement de 0,2 mM. Des concentrations plus élevées peuvent être utiles dans certains cas, notamment en présence de concentrations élevées de Mg²⁺, comme Mg²⁺ se lie aux dNTP et réduit leur taux d'incorporation, augmentant le taux non spécifique. Le dNTP contient du phosphate, qui peut se combiner avec le Mg²⁺ pour réduire la concentration de Mg libre²⁺, donc le changement de sa concentration affectera la concentration effective de Mg²⁺Dans des conditions de concentration élevée d'ADN et de dNTP, le Mg²⁺ La concentration doit être ajustée en conséquence. De plus, la rareté des dNTP conduit à des produits de PCR incomplets. Cependant, les dNTP dépassant les concentrations optimales peuvent inhiber la PCR. Pour une incorporation efficace par l'ADN polymérase, les dNTP libres doivent être présents dans la réaction à une concentration d'au moins 0,01-0,015 mM.

3. Quelles sont les propriétés requises pour un dNTP de haute pureté ?

Depuis sa découverte, la réaction en chaîne par polymérase est l'outil inégalé utilisé dans la recherche en génétique moléculaire. Le dNTP est utilisé dans la PCR pour étendre le brin d'ADN en croissance. Même si la qualité du dNTP dans le système est médiocre, cela aura un impact négatif sur les propriétés du produit final. Le dNTP de haute pureté de Yeasen convient à tous les types d'applications de synthèse d'ADN hautement sensibles et reproductibles.

Yeasen propose des nucléotides, des ensembles et des mélanges de qualité GMP prêts à l'emploi, fournis sous forme de sels de sodium dans de l'eau purifiée à pH 7,0. Le processus de fabrication élimine les impuretés et les inhibiteurs spécifiques de la PCR, et les dNTP sont spécialement fabriqués pour les applications de biologie moléculaire. Les dNTP sont purifiés par HPLC préparative et possèdent une pureté d'au moins 99 %. Ils peuvent être utilisés dans les processus de PCR, RT-qPCR, LAMP, de marquage de l'ADN et de séquençage de l'ADN.
Des normes de contrôle rigoureuses et une technologie de pointe garantissent la meilleure qualité du produit. Chaque lot de dNTP est testé pour divers résidus (ADN bactérien, ADN humain, DNase, RNase, Endonucléase).Le produit est stable d’un lot à l’autre et convient à tous les types d’applications de synthèse d’ADN hautement sensibles et reproductibles.

4. Produits associés et performances

4.1 Aucun résidu d'ADN bactérien

Figure 1. Les résultats de détection montrent que les dNTP ne contiennent aucun résidu de génome bactérien.

4.2 Aucun résidu d'ADN humain

Figure 2. Les résultats de détection montrent que les dNTP ne contiennent aucun résidu de génome humain.

4.3 Aucune contamination par la DNase, la RNase et l'endonucléase

Figure 3. Les résultats de détection montrent que les dNTP n’ont pas de DNase, de RNase et d’endonucléase.

4.4 Amplification par PCR (ADN de 20 kb)

Figure 4. Le résultat de l’amplification PCR est le produit attendu de 20 kb.

4.5 Informations sur les produits

Les produits fournis par Yeasen sont les suivants.

Tableau 1.Informations sur les produits