Ces dernières années, le développement et l'application de la technologie de l'ARNm ont continué d'attirer l'attention. Les médicaments à base d'ARNm impliquent l'inoculation d'ARNm qui code des protéines antigéniques dans le corps humain. En utilisant le matériel génétique à l'intérieur des cellules humaines, elles expriment et synthétisent des protéines antigéniques. Ce processus induit et active le système immunitaire de l'organisme par le biais de protéines antigéniques, dans le but de prévenir et de traiter les maladies. Les médicaments à base d'ARNm présentent des avantages tels que la sécurité, l'efficacité et un cycle court. Ils peuvent induire simultanément une immunité humorale et cellulaire et ont été appliqués dans diverses indications, notamment les tumeurs, les maladies infectieuses, les maladies rares, les maladies cardiovasculaires, etc.
L’ensemble du processus de développement de médicaments à base d’ARNm peut être grossièrement divisé en plusieurs étapes :
Détermination et conception de séquences – Transcription in vitro d’ARNm – Préparation d’encapsulation
Le conventionnel Les étapes de la transcription in vitro (IVT) de l'ARNm comprennent :
Extraction et linéarisation d'ADN plasmidique—Purification de l'ADN plasmidique—Transcription in vitro (coiffage co-transcriptionnel)—Purification—Solution mère d'ARNm
Le pot unique Le processus de transcription in vitro (IVT) de l'ARNm comprend :
Extraction et linéarisation d'ADN plasmidique—Transcription in vitro (coiffage co-transcriptionnel) – Purification – Solution mère d'ARNm
Actuellement, la plupart des procédés existants impliquent une seule étape de purification de l'ADN plasmidique après clivage enzymatique avant l'étape IVT. Yeasen Biotechlogy, s'appuyant sur un centre de développement d'applications d'ARNm mature, a développé le procédé « Onepot mRNA Transcription ». Dans ce procédé, l'ADN plasmidique circulaire n'est pas purifié après clivage enzymatique ; au lieu de cela, il est directement utilisé pour la transcription in vitro, ce qui donne une solution mère d'ARNm de haute qualité. L'ensemble de ce procédé, tout en garantissant la qualité du produit et du procédé, réduit la durée du procédé existant.
Avantages du procédé :
- Optimisation des processus, réduction des étapes IVT pour un fonctionnement plus simple.
- Coûts de matériaux réduits, éliminant le besoin de purification post-clivage et d'inspection de qualité.
- Maintenir la qualité et le rendement de l’ARNm.
Données:
1. Rendements et Intégrité:
En utilisant le 1 μg de plasmides linéarisés 2K, 4K et 9K, le processus onepot peut générer 150 à 200 μg d'ARNm.
| Longueur | Rendements | Intégrité |
| 2K | 200 μg | 94,00 % |
| 4K | 185 μg | 92,20 % |
| 9K | 150 μg | 87,50 % |
Des tests d'intégrité ont été réalisés par électrophorèse capillaire (EC) pour évaluer l'intégrité des fragments de longueurs 2K, 4K et 9K. L'intégrité des fragments de 2K et 4K était > 92 %, et l'intégrité des fragments de 9K était > 87 %.
2. Détection de l'efficacité du coiffage de l'ARNm
La LC-MS a été utilisée pour évaluer l'efficacité de coiffage de la séquence 2K, révélant une efficacité de coiffage de 99,5 %.
Image du haut : Chromatogramme UV HPLC
Image du bas : Spectre de poids moléculaire déconvolué
3. Détection de l'efficacité de la polyadénylation de l'ARNm
La LC-MS a été utilisée pour détecter l'efficacité de polyadénylation des échantillons, montrant des résultats distribués normalement.
Image du haut : Chromatogramme de chromatographie liquide TIC
Image du bas : Spectre de poids moléculaire déconvolué
4.Expression de l'ARNm Essai
Transfection de cellules 293T avec des produits d'ARNm synthétisés en utilisant à la fois le conventionnel processus (À gauche, plasmides linéarisés mavec purification) et le processus one-pot (à droite, plasmides linéarisés sans purification) n'a montré aucune différence dans l'expression des protéines de fluorescence après 24 heures de culture.
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