Kit de synthèse d'ARN à haut rendement T7 optimise le système de réaction de transcription. Le kit peut synthétiser efficacement l'ARN monocaténaire en utilisant l'ARN polymérase T7, l'ADN double brin linéaire avec la séquence promotrice T7 comme matrice et les NTP comme substrat pour contrôler la séquence d'ADN en aval du promoteur. Pendant la transcription, des nucléotides modifiés peuvent être ajoutés au substrat pour préparer de l'ARN marqué à la biotine ou par un colorant.

1. Présentation du kit de synthèse d'ARN à haut rendement T7
2. Principes de in vitro transcription
3. Avantages du kit de synthèse d'ARN à haut rendement Yeasen T7
4. Performances du produit
5. Comment utiliser ce kit
6. Questions fréquemment posées
7. Informations de commande

1. Présentation du kit de synthèse d'ARN à haut rendement T7

Le kit de synthèse d'ARN à haut rendement T7 peut synthétiser à la fois des transcriptions longues et des transcriptions courtes, et l'ARN peut être produit à 100-200 μg avec 1 μg d'entrée de matrice d'ADN. L'ARN synthétisé peut être utilisé pour diverses applications en aval, telles que la recherche sur la structure et la fonction de l'ARN, la protection RNase, l'hybridation de sonde, l'interférence ARN, la microinjection et in vitro traduction.

2. Principes de in vitro transcription

Figure 1. In vitro processus de transcription

3. Avantages du kit de synthèse d'ARN à haut rendement Yeasen T7

Rendements extrêmement élevés – jusqu'à 200 µg en 2 heures
Polyvalent — adapté aux transcriptions d'ARN de 20 à 10 000 nt
Utilisations multiples : génère de l'ARN non marqué, marqué ou coiffé

4. Performances du produit

Figure 2. Comparaison du rendement IVT

Remarque : tous les réactifs de réaction proviennent Kit de synthèse d'ARN T7 (Yeasen#10623 ou société B*). Les rendements de réaction IVT de Yeasen et de la société B* sont indiqués ci-dessus.

Figure 3. La qualité des produits transcriptionnels pour différentes longueurs

Figure 4. Niveau d'expression de l'ARNm transcrit dans les cellules HEK-293

Remarque : l'ARNm est coiffé avec l'enzyme de coiffage de la vaccine (Yeasen#10614/10615)

5. Comment utiliser ce kit

5.1 Réactifs de décongélation

Centrifuger brièvement le mélange d'ARN polymérase T7 et le placer sur de la glace. Décongeler le tampon de transcription 10× et les ribonucléotides (ATP, CTP, GTP, UTP), mélanger et centrifuger jusqu'au fond du tube, placer le tampon de transcription 10× à température ambiante et placer les quatre types de ribonucléotides sur de la glace.

5.2 Préparez le système de réaction de transcription selon le tableau suivant

Tableau 1.Méthode de préparation du système de réaction de transcription

Note:
a) La réaction est préparée à température ambiante. Étant donné que le tampon de transcription 10× contient de la spermidine, une concentration de spermidine trop élevée à basse température entraînera la précipitation de la matrice d'ADN.
b) Transcription courte (<100 nt), un modèle de 2 µg peut être utilisé, le temps de transcription est augmenté à 4-8 heures.
c) Pour les transcriptions longues (> 1000 nt), il est recommandé d'utiliser les modèles plasmidiques linéarisés pour la transcription.
d) Effectuez la réaction dans la machine PCR avec le couvercle chaud ouvert pour éviter que la solution de réaction ne s'évapore pendant une longue période.
e) Le produit de réaction peut avoir un précipité blanc. Il s'agit de pyrophosphate de magnésium formé par des ions pyrophosphate et magnésium libres au cours de la réaction, ce qui n'affectera pas les expériences ultérieures. Vous pouvez ajouter de l'EDTA pour l'éliminer. Si vous craignez que l'ajout d'EDTA affecte les expériences ultérieures, le surnageant peut également être récupéré par centrifugation.
f) Les réactifs et les conteneurs doivent être exempts de contamination par la RNase.

5.3 Incuber à 37°C pendant 2 heures

Mélanger la solution de réaction ci-dessus, centrifuger brièvement au fond du tube et incuber à 37°C pendant 2 heures. Si la longueur de la transcription est inférieure à 100 nt, augmenter le temps de réaction à 4-8 heures.

5.4 Traitement à la DNase I (facultatif)

Une fois la réaction terminée, ajoutez 2 μL de DNase I (sans RNase) à chaque tube et incubez à 37 °C pendant 15 minutes pour éliminer l'ADN matrice.

6. Questions fréquemment posées

6.1 Le rendement de la réaction IVT est faible

La qualité du modèle est étroitement liée au rendement. Si le rendement du groupe expérimental est significativement inférieur à celui du groupe témoin positif, les raisons possibles peuvent être les suivantes.
① Les modèles contiennent des composants qui inhiberont la réaction IVT.
② Il y a un problème avec les modèles.

6.2 Suggestions

① Re-purifier le modèle.
② Confirmer la concentration et l’intégrité des modèles.
③ Prolongez le temps de réaction.
④ Augmentez la saisie du modèle.
⑤Essayez d’autres ARN polymérases et promoteurs correspondants.

6.3 Le rendement des transcriptions courtes est faible

Si les transcriptions cibles sont plus courtes que 100 nt, prolongez le temps de réaction à 4 à 8 heures ou augmentez l'apport de modèles à 2 ug dans un système de réaction de 20 μL.

6.4 Il existe des transcriptions plus longues et inattendues

Si le résultat de l'électrophorèse sur gel montre qu'il existe des transcriptions plus longues et inattendues, les raisons possibles peuvent être :
① Les modèles plasmidiques peuvent ne pas être entièrement linéarisés.
②Les gabarits ont des extrémités cohésives avec des surplombs de 3'.
③Les transcriptions ont une structure secondaire qui n’est pas complètement dénaturée.

6.5 Suggestions

①Vérifiez si les modèles plasmidiques sont entièrement linéarisés. Si nécessaire, effectuez à nouveau la linéarisation du plasmide.
②Sélectionnez les enzymes de restriction appropriées pour linéariser les modèles plasmidiques et éviter de produire des extrémités cohésives avec des surplombs 3'. Il est possible d'utiliser un fragment de Klenow ou une ADN polymérase T4 pour produire une extrémité franche si nécessaire.
③Utilisez un gel dénaturé pour détecter les transcriptions.

6.6 Il existe des transcriptions plus courtes et inattendues

Si le résultat de l'électrophorèse sur gel montre qu'il existe des transcriptions plus courtes et inattendues, les raisons possibles peuvent être :
①Il existe une séquence analogue à la séquence de terminaison de l'ARN polymérase T7 dans les modèles.
②Le contenu GC des modèles est élevé.

6.7 Suggestions

①Diminuez la température de réaction (par exemple 30℃), mais notez que parfois, la diminution de la température de réaction réduira les rendements.
②Essayez d’autres ARN polymérases pour catalyser la réaction IVT.
③Si la teneur en GC des modèles est élevée, réglez la température de réaction IVT à 42℃ ou ajoutez du SSB dans le système de réaction IVT pour augmenter les rendements et la longueur des transcriptions.

6.8 Il y a un maculage des transcriptions pendant l'électrophorèse sur gel

Si les transcriptions s'étalent pendant l'électrophorèse sur gel, les raisons possibles peuvent être :
①Il y a une contamination par l’ARNase pendant l’opération expérimentale.
②Les modèles d’ADN sont contaminés par des ARNases.

6.9 Suggestions

①Assurez-vous que tous les réactifs sont formulés avec de l'eau sans RNase. Utilisez des pointes de pipette sans RNase et des tubes Eppendorf et portez des gants et des masques en latex jetables pendant les opérations expérimentales.
②Re-purifier les modèles d’ADN.

7. Informations de commande

Voici quelques exemples de produits proposés par Yeasen. D'autres tailles sont disponibles. Nos produits sont hautement optimisés pour fonctionner de concert, afin de garantir des performances et une reproductibilité supérieures.
Nous pouvons également fournir des services personnalisés. Si vous êtes intéressé par un produit qui n'est pas présenté, contactez-nous et nous travaillerons avec vous pour répondre à vos besoins.

Tableau 2.Informations sur le produit

Concernant la lecture :

Réactifs de qualité GMP pour la synthèse in vitro d'ARNm

Matières premières pour la synthèse in vitro d'ARNm de qualité GMP de Yeasen Biotechnology