Malgré les bons résultats obtenus pendant la pandémie et le grand potentiel qu’elle présente, la technologie de l’ARNm présente encore plusieurs limites, telles que des temps d’expression courts et une traduction protéique limitée. Bien que ces caractéristiques puissent offrir un certain niveau de sécurité, elles constituent des limites pour des thérapies telles que le remplacement des protéines. Cela nécessite des dosages répétés pour maintenir les niveaux d’expression des protéines, ce qui introduit de nouveaux risques et défis tels que l’immunogénicité et les anticorps neutralisants.
L’ARN auto-amplifiant (saRNA) peut générer la même réponse immunitaire à des doses des centaines, voire des milliers de fois inférieures à celles de l’ARNm traditionnel. Des doses plus faibles signifient des coûts de production plus faibles, et des injections moins fréquentes peuvent réduire les effets secondaires toxiques potentiels de l’ARNm et des vecteurs de transfert. Actuellement, plusieurs candidats saRNA sont entrés dans les essais cliniques à travers le monde. De grandes entreprises comme BioNTech développent activement des pipelines technologiques saRNA.
Bien que le saRNA présente des avantages considérables en termes de coût et de sécurité, sa structure unique présente de nouveaux défis de production. La molécule de saRNA, qui combine la séquence codant l'ARN polymérase avec la séquence de la protéine cible, est beaucoup plus grande (~10 kb) et plus complexe (contenant plus de structures secondaires) que l'ARNm traditionnel. Cela augmente considérablement la difficulté des réactions de transcription in vitro, réduisant le rendement et la pureté de la production de saRNA. Par conséquent, la production de saRNA exige des normes plus élevées dans les processus de synthèse, de séparation et de purification.
La chromatographie d'affinité, une méthode utilisée pour la séparation et la purification, présente des problèmes tels que le faible rendement et l'intégrité du produit cible. La combinaison de plusieurs méthodes de purification chromatographique (par exemple, la chromatographie sur cellulose, la chromatographie en phase inverse hydrophobe) est fastidieuse, introduit de nouvelles impuretés, a de faibles taux de récupération et est coûteuse. De plus, le système de réaction IVT utilisé pour la production à grande échelle est optimisé à partir de systèmes adaptés à la synthèse de séquences d'acides nucléiques de 100 nt, ce qui le rend inadapté au saRNA, dont la taille dépasse 10 kb. Cela nécessite l'optimisation des systèmes de réaction IVT existants. Actuellement, les méthodes conventionnelles de purification de l'ARNm ne peuvent pas répondre aux exigences de qualité des liquides bruts industriels. Par conséquent, il est urgent de développer et d'optimiser un processus de séparation et de purification de qualité industrielle complet et efficace pour l'ARN auto-amplificateur.
Optimisation des méthodes de production et de purification industrielles
Pour développer un système de production industrielle d'ARNm auto-amplifiant (saRNA), il est essentiel d'optimiser d'abord les types d'ions tampon et les composants du système de cotranscription IVT à petite échelle. Cela implique également d'affiner le tampon chromatographique et les ratios de lavage des échantillons pour les processus de purification en aval. Ces conditions optimisées peuvent ensuite être étendues à une production à grande échelle pour vérifier si le système peut augmenter efficacement la capacité de production et améliorer la qualité du produit brut.
Système de réaction d'ajout de capuchon de cotranscription
Dans le système de réaction d'ajout de capuchon de cotranscription, les composants du tampon T7 comprennent 400 mM d'HEPES, 20 mM de spermidine, 100 mM de DTT et des sels de Mg2+.
Tampon T7 - Type de sel d'ions magnésium
Le type de sel d’ion magnésium utilisé affecte le rendement et l’intégrité du produit saRNA cible.
- Pour la synthèse de cotranscription à petite échelle de 1 mg d'ARNm, l'utilisation de Mg(OAc)2 comme sel de Mg2+ donne le meilleur rendement et la meilleure intégrité, avec des valeurs de 100,5 µg et 62,9 %, respectivement.
- En revanche, l’utilisation d’autres sels d’ions magnésium tels que MgCl2 et MgSO4 réduit le rendement d’environ 25 à 50 % et l’intégrité d’environ 10 %, ce qui diminue considérablement le rendement et l’intégrité.
Tampon T7 - Concentration en ions magnésium
Une concentration optimale d'ions acétate de magnésium (30-50 mM) améliore le rendement et l'intégrité de l'ARNsa cible, avec les meilleurs résultats à 35 mM.
- À une concentration en ions acétate de magnésium de 30 à 50 mM, le rendement en saRNA atteint 88,5 à 100,5 µg et l'intégrité est de 58,6 à 62,9 %, montrant de bons résultats.
- À une concentration de 35 mM, le rendement et l'intégrité sont à leur maximum, atteignant respectivement 100,5 µg et 62,9 %.
Tampon T7 - Sel d'ion magnésium combiné à d'autres sels
L’ajout d’autres sels au tampon T7 peut améliorer considérablement le rendement et l’intégrité du produit cible.
- Le tampon de base T7 comprend 400 mM d'HEPES, 20 mM de spermidine, 100 mM de DTT et des sels de Mg2+, ce qui donne un rendement et une intégrité de 100,5 µg et 62,9 %, respectivement.
- L'ajout d'un deuxième sel, NaOAc, améliore encore le rendement et l'intégrité : le rendement augmente de 20 à 110 µg et l'intégrité s'améliore d'environ 2 à 8 %.
Tampon T7 - Concentration des sels combinés
Lorsque le deuxième composant salin NaOAc (Na+) est à une concentration de 5 à 30 mM, le rendement et l'intégrité de l'ARNsa cible s'améliorent considérablement, avec la meilleure concentration à 15 mM.
- À des concentrations de Na+ de 3 à 30 mM, le rendement en saRNA atteint 120 à 210 µg et l'intégrité est de 64,4 à 70,2 %, montrant de bons résultats.
- À une concentration en Na+ de 15 mM, le rendement et l'intégrité sont à leur maximum, atteignant respectivement 210 µg et 70,2 %.
Méthodes de purification uniques
Lors de la production et de la purification d'ARNsa à petite échelle (< 50 mg), l'utilisation de différentes méthodes de purification peut réduire considérablement la teneur en ARNdb et les résidus protéiques, garantissant un rendement élevé, une efficacité de coiffage et l'intégrité du produit. L'efficacité des méthodes de purification, de la meilleure à la pire, est la suivante : chromatographie d'affinité > précipitation au chlorure de lithium > ultrafiltration, chromatographie sur cellulose.
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Chromatographie d'affinité
Pour la production d'ARNm à grande échelle, la chromatographie est préférable. Les options incluent la chromatographie en phase inverse, la chromatographie par échange d'ions, la chromatographie hydrophobe et la chromatographie d'affinité, chacune ayant ses avantages et ses inconvénients. La chromatographie d'affinité, souvent utilisée pour capturer l'ARNm poly(A), offre des solutions d'évolutivité et de plate-forme avec des taux de récupération > 90 %.
Les caractéristiques structurelles clés de l'ARNm, la coiffe 5' et la queue poly(A) 3', facilitent la purification. La chromatographie d'affinité, similaire à la purification par billes magnétiques, utilise des billes liées à dT pour capturer l'ARNm à queue poly(A). Les conditions de salinité élevée protègent les charges négatives, permettant la liaison par des liaisons hydrogène AT, et l'ARNm est élué sous un pH neutre doux et une faible conductivité.
La chromatographie d'affinité pour l'ARN implique une « forte liaison au sel et une faible élution au sel ». La composition du tampon, la taille moléculaire, la température et la concentration de l'échantillon ont un impact significatif sur le processus. La sélection du type de sel et de la concentration optimale par l'expérimentation est essentielle pour une purification efficace.
Purification : Cette méthode donne l'intégrité du produit la plus élevée (80,3 %), la teneur en dsRNA la plus faible (0,01 µg/mg), l'efficacité de coiffage la plus élevée (96,4 %) et le moins de résidus protéiques (1,20 µg/mg), avec un rendement de 136 µg et un taux de récupération de 65 %, ce qui en fait la meilleure en termes de pureté et de qualité du produit.
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Autres méthodes de purification :
Précipitation de chlorure de lithium
Le principe de la purification de l’ARNm à l’aide de LiCl est que le lithium peut réduire la répulsion électrostatique entre les molécules à un certain pH, permettant une précipitation efficace de l’ARN.Le précipité est ensuite séparé par centrifugation, dissous pour obtenir un échantillon d'ARN pur. La précipitation au LiCl est simple, rapide, efficace pour les ARNm de différentes tailles et donne des produits de haute pureté. Cependant, les ions lithium résiduels peuvent inhiber l'ARNm. Il est recommandé d'utiliser la précipitation au LiCl pour les solutions contenant au moins 400 µg/ml d'ARN afin de garantir l'efficacité de la purification. Cette méthode produit un rendement élevé (210 µg), mais l'intégrité du produit n'est que de 70,2 %, ce qui réduit considérablement la qualité du produit. Elle n'est pas adaptée à la production à grande échelle.
Méthode des billes magnétiques :
Les billes magnétiques sont de petites particules qui se déplacent de manière directionnelle sous l'effet d'un champ magnétique, généralement composées d'un noyau d'oxyde de fer et d'un revêtement externe. La purification par billes magnétiques est une technique courante de biologie moléculaire pour enrichir rapidement et efficacement les molécules d'ARNm à partir de mélanges. Différentes billes magnétiques fonctionnelles ont différents groupes fonctionnels de surface (par exemple, hydroxyle, carboxyle, Oligo(dT), streptavidine) pour purifier diverses biomolécules.
Les billes magnétiques carboxylées peuvent purifier efficacement les acides nucléiques, les molécules d'ARNm se liant par des interactions électrostatiques dans des conditions acides. L'ajustement des conditions permet la liaison sélective et la libération de l'ARNm. Les ARNm plus longs avec des groupes phosphates chargés négativement plus exposés se lient plus facilement aux billes. Pour les ARNm plus courts, des volumes de billes plus importants peuvent être nécessaires. Les billes magnétiques couplées à l'oligo(dT), similaires à la chromatographie d'affinité, utilisent une liaison spécifique entre la queue poly(A) de l'ARNm et l'oligo(dT) des billes.
Ultrafiltration
Cette méthode produit l'intégrité saRNA la plus faible, environ 8 % inférieure à la chromatographie d'affinité, avec le résidu protéique le plus élevé (4,58 µg/mg).
Chromatographie sur cellulose
Cette méthode permet d'obtenir une faible teneur en ARNdb (0,009 µg/mg) et un taux de capsulage élevé (96,4 %). Cependant, les résidus protéiques sont légèrement plus élevés (5,30 µg/mg), avec un taux de récupération de seulement 57 % et un rendement de 120 µg, tous deux significativement inférieurs à ceux obtenus avec la chromatographie d'affinité (d'environ 10 % et 16 µg, respectivement).
Processus de purification
Composants du tampon chromatographique - Ajout d'agents réducteurs
L'ajout d'agents réducteurs au tampon chromatographique pendant la purification peut améliorer considérablement l'intégrité du produit, le taux de récupération et l'efficacité du bouchage, tout en réduisant les niveaux de résidus d'ARNdb et de protéines sous-produits par rapport à l'absence d'ajout d'agents réducteurs.
- Sans agents réducteurs :
- Rendement : 136µg
- Taux de récupération : 65 %
- Intégrité : 80,3 %
- ARNdb : 0,01 µg/mg
- Efficacité de capsulage : 96,4 %
- Résidu protéique : 1,20 µg/mg
- La pureté et la qualité du produit sont bonnes.
- Avec des agents réducteurs (TCPE, DTT, β-mercaptoéthanol) :
- Le rendement augmente de 10 à 40 µg
- Le taux de récupération augmente de 5 à 18 %
- L'intégrité s'améliore d'environ 1 à 5 %
- Efficacité de capsulage : 96,4 %
- ARNdb : aussi faible que 0,005 µg/mg
- Résidu protéique : aussi faible que 0,20 µg/mg
- Amélioration significative de la pureté et de la qualité du produit.
Composants des tampons chromatographiques – Types d'agents réducteurs
Différents types d'agents réducteurs ajoutés au tampon chromatographique peuvent améliorer davantage l'intégrité du produit, le taux de récupération et l'efficacité du bouchage, tout en réduisant les résidus d'ARNdb et de protéines. Le TCPE s'avère être l'agent réducteur le plus efficace.
- Avec TCPE :
- Rendement : 175µg
- Taux de récupération : 83 %
- Intégrité : 85,2 %
- ARNdb : 0,005 µg/mg
- Efficacité de capsulage : 96,4 %
- Résidu protéique : 0,20 µg/mg
- Excellente pureté et qualité du produit.
Composants du tampon chromatographique - Concentration des agents réducteurs
L'ajout d'agents réducteurs à une concentration de 5 à 15 mM dans le tampon chromatographique peut améliorer considérablement l'intégrité du produit, le taux de récupération et l'efficacité du bouchage, tout en réduisant les résidus d'ARNdb et de protéines. La concentration optimale est de 10 mM.
- Ajout de 5 à 15 mM de TCPE :
- Rendement : 160-178µg
- Taux de récupération : 76-85 %
- Intégrité : environ 85 %
- ARNdb : 0,002-0,005 µg/mg
- Efficacité de capsulage : 96,4 %
- Résidu protéique : 0,20-0,52 µg/mg
- Bonne pureté et qualité du produit.
- Avec 10 mM TCPE :
- Rendement : 178µg
- Taux de récupération : 85 %
- Intégrité : 85,4 %
- ARNdb : 0,002 µg/mg
- Efficacité de capsulage : 96,4 %
- Résidu protéique : 0,20 µg/mg
- Pureté et qualité optimales du produit.
Rapport de lavage
Le contrôle du rapport entre le tampon chromatographique et l'eau d'injection dans le processus de lavage (10-25) : (75-90) peut améliorer considérablement l'intégrité du produit, le taux de récupération et l'efficacité du bouchage, tout en réduisant les résidus d'ARNdb et de protéines. Le rapport optimal est de 15:85.
- Rapport (10-25) : (75-90) :
- Rendement : 150-179µg
- Taux de récupération : 71-85 %
- Intégrité : 84-90%
- ARNdb : 0,002-0,006 µg/mg
- Efficacité de capsulage : 96,4 %
- Résidu protéique : environ 0,20 µg/mg
- Bonne pureté et qualité du produit.
- Avec un ratio de 15:85 :
- Rendement : 179µg
- Taux de récupération : 85 %
- Intégrité : 90,0 %
- ARNdb : 0,002 µg/mg
- Efficacité de capsulage : 96,4 %
- Résidu protéique : 0,20 µg/mg
- Pureté et qualité optimales du produit.
Méthodes de purification combinées
L'utilisation d'une combinaison de différentes méthodes de purification peut réduire davantage les niveaux de résidus d'ARNdb et de protéines dans le produit, améliorant ainsi la qualité globale. L'ordre préféré des méthodes de purification est le suivant : chromatographie d'affinité > ultrafiltration + chromatographie d'affinité > chromatographie d'affinité + chromatographie sur cellulose > chromatographie sur cellulose + ultrafiltration. La chromatographie d'affinité seule donne les meilleurs résultats.
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Chromatographie d'affinité seule :
- Rendement : 179µg
- Taux de récupération : 85 %
- Intégrité : 90,0 %
- ARNdb : 0,002 µg/mg
- Efficacité de capsulage : 96,4 %
- Résidu protéique : 0,20 µg/mg
- Pureté et qualité de produit les plus élevées.
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Ultrafiltration + Chromatographie d'affinité :
- Rendement : 170µg (9µg de moins que la chromatographie d'affinité seule)
- Taux de récupération : 81 % (4 % de moins que la chromatographie d'affinité seule)
- Intégrité : 88,5 %
- ARNdb : 0,0015 µg/mg
- Résidu protéique : 0,18 µg/mg
- Légère réduction des résidus d'ARNdb et de protéines par rapport à la chromatographie d'affinité seule, mais réduction significative du rendement et du taux de récupération. Cette méthode est plus complexe, doublant le temps de purification et augmentant les coûts.
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Chromatographie d'affinité + Chromatographie sur cellulose / Chromatographie sur cellulose + Ultrafiltration :
- dsRNA : 0,005 µg/mg de moins que les méthodes simples
- Rendement : 60-100µg de moins
- Taux de récupération : 30 à 40 % inférieur
- L'augmentation du nombre d'étapes entraîne des coûts de main-d'œuvre et de matériaux plus élevés.
Production à grande échelle
Dans la production à grande échelle, en utilisant la chromatographie d'affinité, la chromatographie d'affinité combinée à la chromatographie sur cellulose ou l'ultrafiltration combinée à la chromatographie d'affinité, le rendement d'ARNm auto-amplifiant augmente considérablement jusqu'à 140-185 µg, avec un taux de récupération de 67-88 %. L'intégrité du produit est de 93-94 %, la teneur en ARNdb est contrôlée entre 0,0018 et 0,0020 µg/mg, l'efficacité de coiffage atteint 96,1-96,4 % et les résidus protéiques sont maintenus entre 0,04 et 0,05 µg/mg. Cela démontre une bonne évolutivité et une bonne efficacité pour la production à grande échelle.
Référence:
[8] Méthodes de production industrielle et de purification par séparation de liquide brut d'ARNm auto-amplifiant et ses applications [P]. Brevet : CN118048418A. 2024.05.17.
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