La structure Cap est un élément essentiel dans le développement de vaccins et de produits thérapeutiques à base d'ARNm. La technologie de l'ARNm synthétique s'appuie sur Cap1 pour améliorer la stabilité, l'efficacité de la traduction et réduire la reconnaissance immunitaire innée de l'ARNm par les récepteurs de type Toll (TLR) et d'autres capteurs immunitaires, minimisant ainsi l'activation immunitaire indésirable. Cela empêche les réponses inflammatoires indésirables, améliorant ainsi la stabilité et l'efficacité de l'ARNm thérapeutique dans les cellules humaines.
Découverte précoce et structure de Cap0
Au milieu des années 1970, des recherches sur l'ARNm eucaryote ont permis de découvrir une structure terminale 5' désormais connue sous le nom de Cap0, où une coiffe N7-méthylguanosine (m7G) est attachée au premier nucléotide à l'extrémité 5'. On a découvert que cette modification protégeait l'ARNm de la dégradation par les exonucléases, facilitait l'exportation nucléaire et favorisait la reconnaissance des ribosomes pour l'initiation de la traduction. Cap0 a été la première structure de coiffe caractérisée, sa méthylation étant limitée à la coiffe de guanosine elle-même. La découverte de cette coiffe 5' et de ses fonctions a marqué une avancée significative dans la compréhension des coiffes d'ARNm eucaryotes et de leur rôle dans les modifications de l'ARNm.
L'émergence de Cap1
La structure Cap1, une caractéristique essentielle de l'ARNm eucaryote, joue un rôle essentiel dans la stabilité, la traduction et la reconnaissance immunitaire de l'ARNm. La structure de la coiffe de l'ARNm, constituée d'une N7-méthylguanosine (m7G) liée au premier nucléotide par une liaison triphosphate 5'-5', a évolué à partir des premières études sur les modifications post-transcriptionnelles de l'ARNm eucaryote dans les années 1970.
Structure des ARNm coiffés à l'extrémité 5'.【1】 Des recherches plus poussées ont révélé que dans la plupart des ARNm eucaryotes, le premier nucléotide suivant la coiffe (position +1) est également méthylé à la position 2'-O du ribose, un processus connu sous le nom de méthylation 2'-O. Cette découverte, connue sous le nom de structure Cap1 (m7GpppNm), a ajouté une autre couche d'importance fonctionnelle aux modifications de l'ARNm. On a découvert que la modification Cap1 affine la stabilité de l'ARNm et empêche la reconnaissance immunitaire par le système immunitaire inné, en particulier dans les cellules de mammifères, où elle aide à échapper à la reconnaissance par les récepteurs de reconnaissance de formes comme RIG-I, TLR et MDA5【2】. Cela était crucial à la fois pour le métabolisme de l'ARNm et pour l'avancement des technologies basées sur l'ARNm, y compris la vaccination par ARNm et les applications de thérapie génique.
Défis techniques dans l'industrie de l'ARNm et solutions actuelles
Plusieurs défis techniques demeurent dans l'application et l'optimisation généralisées des vaccins à ARNm, notamment les problèmes liés à l'ARNm à haute dose, aux réponses immunitaires, à la stabilité et à l'administration. Un défi important dans l'industrie de l'ARNm est la nécessité de doses élevées d'ARNm pour provoquer une réponse immunitaire robuste. Cela est dû à plusieurs facteurs :
Dégradation rapide : L'ARNm est intrinsèquement instable et susceptible d'être dégradé par les enzymes de décapsulage et les ribonucléases (ARNases) présentes dans les systèmes biologiques.
Efficacité translationnelle limitée : L'efficacité avec laquelle l'ARNm est traduit en protéine peut varier, nécessitant des quantités plus élevées d'ARNm pour générer des niveaux d'antigène suffisants pour une réponse immunitaire. L'efficacité de la traduction est liée à l'affinité de Cap1 et du facteur d'initiation de la traduction eIF4E.
La formation du complexe d'initiation de la traduction de base chez les eucaryotes.【3】
Immunogénicité et réactions immunitaires indésirables : Le troisième obstacle majeur est la réponse immunitaire innée qui peut être déclenchée par l’ARNm lui-même, en particulier dans le cas de l’ARNdb ou de l’ARNm incomplet. Bien qu’un certain niveau d’activation immunitaire soit souhaité pour stimuler le système immunitaire adaptatif, une activation excessive peut entraîner des réponses inflammatoires, qui peuvent réduire l’efficacité du vaccin ou provoquer des effets secondaires.
Histoire de la technologie de capsulage
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Technologie de bouchage enzymatique : Le coiffage enzymatique, introduit au début de la recherche sur l'ARNm, consiste à utiliser des enzymes de coiffage comme la guanylyltransférase et la méthyltransférase pour ajouter un capuchon 5' naturel après la transcription. Cette méthode garantit une grande fidélité et une efficacité de coiffage dans la traduction de l'ARNm, en particulier pour les applications thérapeutiques.
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Analogues de la capitalisation synthétique (années 1980-2000) : Les chercheurs ont développé des analogues synthétiques de capuchon pour la synthèse in vitro d'ARNm coiffé, aidant à étudier la fonction de l'ARNm et l'expression des gènes. L'analogue de capuchon anti-inverse (ARCA) est un analogue de capuchon synthétique conçu pour empêcher l'incorporation incorrecte de capuchon pendant la synthèse de l'ARNm, améliorant ainsi l'efficacité de la traduction de l'ARNm pour les vaccins et les thérapies géniques. Cependant, l'efficacité du coiffage et le rendement du coiffage ARCA sont faibles.
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Technologie Cap1 (années 2010) : La méthode Cap1 de TriLink est une méthode de co-coiffage transcriptionnel qui simplifie le processus en incorporant le capuchon directement lors de la synthèse de l'ARNm. Cette méthode améliore l'efficacité et produit un pourcentage élevé d'ARNm correctement coiffé, ce qui la rend idéale pour les applications thérapeutiques à grande échelle comme les vaccins à ARNm.
Actuellement, les technologies de coiffage enzymatique sont essentielles au développement de thérapies à base d’ARNm, notamment les vaccins contre la COVID-19, garantissant la stabilité et la traduction efficace de l’ARNm thérapeutique.
Comparaison du capsulage enzymatique, la nouvelle génération LZCap Capping et la méthode de capsulage de première génération (ARCA)
Développement d'analogues de capsules de nouvelle génération
Notre objectif était de développer des analogues de capsulage résistants aux enzymes de décapsulage, présentant une forte affinité pour eIF4E afin d'améliorer l'efficacité de la traduction et une immunogénicité plus faible. Ces avancées sont cruciales pour améliorer l'efficacité des thérapies à base d'ARNm, notamment les traitements anticancéreux et les applications de thérapie génique.
Conception de LZCap
Lors de la conception de LZCap, nous nous sommes principalement concentrés sur la création d'un analogue de capuchon avec une affinité élevée pour eIF4E. Les enzymes ont une reconnaissance relativement « spécifique » des substrats. Par conséquent, lors de la conception d'une nouvelle structure de capuchon, nous nous efforçons de maintenir autant que possible la similitude avec les structures naturelles/connues. La structure naturelle a un ribose 3' OH, qui peut être modifié (par exemple, méthylation). Sur la base de cette considération, nous avons choisi d'ajouter un carbone en position 3' pour la nouveauté, suivi d'un NH pour imiter la liaison hydrogène de OH, puis d'un groupe acétyle pour réduire la basicité de NH et améliorer sa capacité de liaison hydrogène. L'activité de LZCap est meilleure que celle du capuchon naturel méthylé, probablement en raison d'une augmentation des liaisons hydrogène. Par rapport aux groupes méthyle et méthoxy, le groupe amino acétyle peut également augmenter les interactions de van der Waals entre le substrat (capuchon) et le facteur initiateur (enzyme).
Stabilité du groupe amino acétyl
Le groupe amino acétyl est déjà suffisamment stable. Il est beaucoup plus stable que la position 7-méthylée et la liaison phosphodiester, qui sont les parties les moins stables de la coiffe.
Rendement et efficacité de bouchage de LZCap
Avec le capuchon LZCap AG(3'Acm), l'efficacité de coiffage de l'ARNm de la luciférase est d'environ 97,59 %, et jusqu'à 200 μg d'ARNm coiffé peuvent être obtenus avec 1 μg de matrice d'ADN dans une réaction de transcription in vitro (IVT) standard avec l'ARN polymérase T7. La pureté de l'ARNm atteint jusqu'à 99 % après une simple précipitation au LiCl. Cette efficacité de coiffage et ce rendement élevés font de LZCap une option intéressante pour diverses applications, notamment la production de protéines et la thérapie génique.
La structure Cap est un composant essentiel dans le développement de vaccins et de thérapies à ARNm.La technologie de l'ARNm synthétique s'appuie sur Cap1 pour améliorer la stabilité, l'efficacité de la traduction et réduire la reconnaissance immunitaire innée de l'ARNm par les récepteurs de type Toll (TLR) et d'autres capteurs immunitaires, minimisant ainsi l'activation immunitaire indésirable. Cela empêche les réponses inflammatoires indésirables, améliorant ainsi la stabilité et l'efficacité de l'ARNm thérapeutique dans les cellules humaines.
| Produit | Capuchon AG (3'-OMoi-7mG) | Capuchon LZ AG(3'Acm) | AG (pas de plafonnement) |
| Rendement de l'ARNm (µg) | 164 | 173 | 200 |
Analyse MS de l'efficacité de coiffage de l'ARNm de la luciférase LZCapped avec une méthode basée sur l'ARNase H. L'efficacité de coiffage est d'environ 97,59 %,
Quelle est la stabilité de l'ARNm vis-à-vis de l'enzyme de décapsulage
Les ARNm avec LZCap AG (3'Acm) et LZCap AG M6 (3'Acm) présentent une résistance plus élevée à l'enzyme de décapsulage (NEB). Il est à noter que CapM6 (3'-OMe-6mA-7mG) est également résistant à l'enzyme de décapsulage, mais le Cap AG normal (3'-OMe-7mG) ne présente pas de résistance.
Quelle est l'affinité de liaison de LZCap à eIF4E ?
Qu'en est-il de l'expression protéique de l'ARNm coiffé de LZCap AG (3'Acm) ?
Français L'expression de l'ARNm de la luciférase coiffée par LZCap AG(3'Acm) est significativement plus élevée que celle de l'ARNm coiffé par l'analogue Cap1 (3'-OMe-7mG) dans différentes lignées cellulaires* (3T3-L1, Hela, JAWs, HEK293T et Huh7). L'expérience de 130 répétitions a montré une expression environ 1,5 fois plus élevée de l'ARNm de la luciférase coiffée par LZCap AG(3'Acm) que de l'ARNm coiffé par (3'-OMe-7mG) en moyenne. Des résultats similaires sont observés chez la souris. Le niveau d'expression des protéines peut varier légèrement selon la séquence d'ARNm.
Avez-vous plus de données sur les animaux ?
L'efficacité d'expression de LZCap AG(3'Acm) ou LZCap AG(3'FMom) plafonnée
L'ARNm codant pour GLuc montre une expression in vivo plus élevée par rapport aux ARNm coiffés de CapAG (3'-OMe-7mG) chez le singe cynomolgus et le porc.
Qu'en est-il de l'immunogénicité innée des ARNm coiffés de LZCap AG ?
Les ARNm coiffés de LZCapAG (3'Acm) présentent une faible immunogénicité innée. TLR8, TLR7, IL-1A et B jouent un rôle important dans la réponse immunitaire induite par l'ARN non coiffé. Les études in vivo d'analyse de l'immunogénicité de l'ARNm coiffé de LZCap ont montré que l'ARN non coiffé provoquait des changements significatifs dans le niveau de transcription des facteurs liés à l'immunité chez la souris. Les ARNm coiffés de LZCap et de 3'-OMe-7mG présentent tous deux un niveau de transcription de facteurs immunitaires inférieur similaire chez la souris après une seule injection stimulée par l'ARN.
Avez-vous fait des tests de sécurité ?
Oui, nous avons effectué un test de cytotoxicité, une étude d’inhibition de la polymérase humaine et un test d’Ames.
- Aucune ou peu de cytotoxicité n'a été observée pour le monomère nucléosidique de 3'-Acm-7mG (CC50 > 10 000 nM) dans les cellules 293T, Huh7, MRC5, THP1 et U87MG.
- ADN polymérase humaine ( α ,β , γ et Klenow) et les études d'inhibition de l'activité de l'ARN polymérase mitochondriale (hPOLRMT) montrent que le 3'-Acm-7mG TP n'inhibe pas l'ADN ou l'ARN polymérase humaine.
- Le test de mutation bactérienne inverse (Ames) détecte les altérations génétiques associées, ainsi que les carcinogènes génotoxiques chez la plupart des rongeurs et des humains. Le test d'Ames a montré que le 3'-Acm-7mG n'a aucune génotoxicité.
Ce produit a-t-il été breveté ?
Oui, le brevet a été accordé aux États-Unis.
Informations de commande
| Nom du produit | Caractéristiques | Numéro de catalogue |
| Capuchon LZ AG(3'Acm)（ 100 mM) | 100 μL, 1 mL | 10684ES |
| Capuchon LZ UA(3'Acm)（ 100 mM） | 100 μL, 1 mL | 10685ES |
| Capuchon LZ GG(3'Acm)（ 100 mM) | 100 μL, 1 mL | 10686ES |
| LZCap AG (3'Ma-Cy5) ( 25 mM) | 100 μL, 1 mL | 10688ES |
| Capuchon LZ AG(3'Ma-Cy7)（ 25 mM） | 100 μL, 1 mL | 10689ES |
| LZCap (AG(3'Ma-Cy3) (25 mM) | 100 μL, 1 mL | 10687ES |
| LZCap (AG(3'Ma-Biotine) (25 mM) | 100 μL, 1 mL | Enquête |
| LZCap (AG(3'Ma-Peg5-FAM) (25 mM) | 100 μL, 1 mL | Enquête |
| LZCap (AG(3'Ma-C6-MANT) (25 mM) | 100 μL, 1 mL | jeDemande de renseignements |
| LZCap (AG(3'Acm) ARNm de la luciole luc (1 μg/μL) | 100 μL, 1 mL | jeDemande de renseignements |
| LZCap (ARNm eGFP AG(3'Acm) (1 μg/μL) | 100 μL, 1 mL | jeDemande de renseignements |
| LZCap (AG(3'Acm) eGFP saARN (1 μg/μL) | 100 μL, 1 mL | jeDemande de renseignements |
| LZCap (ARNm RFP AG(3'Acm) (1 μg/μL) | 100 μL, 1 mL | Enquête |
| LZCap (ARNm AG(3'Acm) Cas9 (1 μg/μL) | 100 μL, 1 mL | jeDemande de renseignements |
| LZCap (ARNm AG(3'Acm) Gluc (1 μg/μL) | 100 μL, 1 mL | jeDemande de renseignements |
Référence:
- Mécanismes moléculaires du coiffage et de la méthylation de l'ARN du coronavirus, Virologica Sinica 31(1)
- Vaccins à ARNm : une nouvelle ère en vaccinologie. Rév. Nat. Découverte des drogues 17, 261–279 (2018).
- Initiation de la traduction régulée par la protéine de liaison à l'ARN chez les mammifères : modulation du complexe d'initiation de la traduction par des facteurs agissant en trans et des cellules 2021, 10(7), 1711