Le séquençage de nouvelle génération (NGS) a montré des perspectives d'application de recherche clinique et scientifique extrêmement larges dans des domaines tels que la détection d'agents pathogènes, la détection de mutations tumorales et la génétique de la reproduction en raison de sa sensibilité de détection élevée, de sa forte spécificité et de sa capacité à effectuer une détection qualitative et quantitative. La construction d’une bibliothèque, en tant qu’étape essentielle du NGS, affecte directement la qualité du séquençage. Conformément aux directives d'examen de l'enregistrement des produits de diagnostic in vitro (DIV), des données de recherche sur les principales matières premières doivent être fournies. Une analyse et une vérification complètes doivent être réalisées en combinant des facteurs tels que les informations de base, les indicateurs de paramètres et les sources d'approvisionnement des matières premières pour déterminer la source de matières premières la plus appropriée. Le processus de construction de bibliothèques d'ADN et d'ARN conventionnelles comprend principalement des étapes clés telles que la synthèse d'ADNc, la fragmentation de l'ADN, la ligature de l'adaptateur et l'amplification de la bibliothèque, Les différentes étapes impliquent de nombreux types d'enzymes de matières premières. Le criblage des enzymes de matières premières allonge considérablement le cycle de recherche. Sur cette base, les modules de construction de bibliothèque économiques et simples sont devenus un nouveau choix pour le développement de produits IVD.
Figure 1. Processus de construction d'une bibliothèque d'ADN conventionnelle (à gauche) et processus de construction d'une bibliothèque d'ARN (à droite), en prenant la plateforme Illumina comme exemple
La synthèse par transcription inverse est la partie centrale de l'ARN-Seq, Nouveau type de haut transcriptase inverse à haute efficacité, qui intègre de multiples fonctions telles qu'une sensibilité élevée, une haute rendement de l'ADNc et la compatibilité avec des modèles de structures complexes constituent un point chaud de recherche. La plateforme de modification enzymatique ZymeEditor™ de Yeasen a permis d'obtenir un produit de transcription inverse complet avec des performances considérablement améliorées grâce à la modification directionnelle de M-MLV. Il peut être utilisé dans de multiples scénarios d'application tels que l'ARN-seq, le séquençage de cellules uniques, le clonage d'ADNc et la construction de bibliothèques.
Figure 2. Performances de 13488ES appliquées dans RNA-seq
Limité par la courte longueur de lecture de la plateforme de séquençage, l'ADN doit être fragmenté de manière aléatoire avant la construction de la bibliothèque. Au début, la fragmentation enzymatique était intimidante en raison de problèmes d’uniformité et de biais. Biotechnologie Yeasen a développé deux enzymes de fragmentation uniques, Une enzyme de fragmentation à action vigoureuse qui fonctionne à 37℃ pendant 3 à 30 minutes et une enzyme de fragmentation à action douce qui fonctionne à 30 ℃ pendant 10 à 40 minutes. Les produits de fragmentation enzymatique basés sur la fragmentation aléatoire améliorent progressivement leurs défauts, Ils sont combinés en produits modulaires pour la fragmentation de l'ADN, la réparation des extrémités et la queue A qui répondent aux nombreuses exigences de différents échantillons et de différents types de séquençage.
Figure 3. Effets de fragmentation de différentes enzymes de fragmentation de l'ADN : enzyme de fragmentation à action vigoureuse (à gauche) et enzyme de fragmentation à action modérée (à droite)
Le taux de conversion de la bibliothèque est un indicateur important pour évaluer la qualité de la bibliothèque. Un taux de conversion de bibliothèque élevé signifie dans une certaine mesure une meilleure richesse de la bibliothèque et une meilleure uniformité des données de séquençage. L'ADN ligase T4 conventionnelle se concentre sur l'optimisation de la ligature à haute efficacité, mais les fragments sont sujets à l'auto-ligature, ce qui réduit le taux de conversion de la bibliothèque et affecte la richesse de la bibliothèque et la qualité du séquençage. La plateforme d'ingénierie enzymatique Yeasen ZymeEditor™ effectue une modification directionnelle sur l'ADN ligase T4 pour obtenir un nouveau mutant, combiné à un tampon de ligature soigneusement optimisé, le produit du module de ligature avec une stabilité thermique élevée et un faible taux d'auto-ligature des fragments a été développé, ce qui améliore considérablement le taux de conversion de la bibliothèque.
Figure 4. Stabilité thermique et analyse des résidus de liaison de 12996ES
Les enzymes d’amplification PCR sont toutes nécessaires dans les méthodes de préparation de bibliothèques NGS. La plupart des ADN polymérases haute fidélité ont une activité polymérase 5'→3' et une activité exonucléase 3'→5'. Il peut synthétiser l'ADN dans la direction 5'→3' tout en corrigeant les bases incorporées par erreur, Ainsi, il peut amplifier rapidement et avec une grande fidélité des fragments d’ADN. Mais peu d’enzymes sont spécifiquement conçues pour le NGS, Il n’existe pas beaucoup de produits d’amplification de bibliothèque qui soient efficaces, précis, spécifiques et capables d’amplifier des cibles de différentes tailles et de différents contenus en GC sans biais, tout en ayant la capacité de prémélanger les amorces à l’avance. Yeasen Biotechnology a développé une ADN polymérase de haute précision avec une conception unique et un prémélange PCR à démarrage à chaud optimisé. Elle est spécifiquement conçue pour une amplification de bibliothèque NGS efficace, haute fidélité et à faible biais, répondant aux défis de l'amplification de bibliothèque NGS complexe.
Figure 5. Analyse de la stabilité et du taux d'erreur d'amplification de 12980ES
En plus de la série ci-dessus de produits de modules de construction de bibliothèque NGS, Nous fournissons également des produits enzymatiques bruts à guichet unique, pour répondre aux besoins combinés de différents clients. Les matières premières de construction de bibliothèque NGS de Yeasen sont soumises à des normes strictes de contrôle de qualité en usine, à un contrôle strict des performances des lots et à un contrôle de qualité de stabilité, afin que vous puissiez construire des bibliothèques sans souci.
| Catégorie de produit | Nom du produit | N° de cat. | Remarque |
| Synthèse efficace d'ADNc | Hifair™ Transcriptase inverse ultra (200 U/μL) | 14604ES | Enzyme de transcription inverse |
| Système de surveillance de la glycémie haute performance (NGS) de Hieff Kit de synthèse ds-cDNA | 13488ES | Module de synthèse d'ADNc | |
| ADN Fragmentation et réparation des extrémités et queues A | Hieff™ Smérase | 12907ES | ADN fragmentase |
| Module de fragmentation d'ADN Hieff NGS™ OnePot Pro (réparation des extrémités et dA-tailing plus) | 12619ES | ADN Module de fragmentation, de réparation des extrémités et de queue A | |
| Réparation et suivi | Module de réparation d'extrémité/dA-Tailing rapide Hieff NGS® | 12608ES | Module de réparation d'extrémité et de queue A |
| Ligature de l'adaptateur | 10299ES | ADN ligase T4 | |
| Amplification de la bibliothèque | 2× Ultima HF Amplification Mix | 13344ES | Enzyme haute fidélité |