Guide complet de la culture organoïde

— Un article complet pour approfondir votre compréhension des organoïdes.

Introduction aux organoïdes

Les organoïdes sont des structures tridimensionnelles dotées de fonctions physiologiques qui imitent l'état normal (ou pathologique) des organes ou tissus internes, obtenues par culture 3D à l'extérieur du corps. En termes plus simples, les organoïdes sont des cultures cellulaires tridimensionnelles dans lesquelles les cellules souches sont cultivées dans un gel matriciel. Sous l'influence d'inhibiteurs/activateurs chimiques, de cytokines et d'additifs de culture, les organoïdes se développent en structures tissulaires similaires aux organes correspondants.

Caractéristiques des organoïdes

Les organoïdes possèdent des capacités d'auto-renouvellement, préservant la structure physiologique et la fonction du tissu source. On les appelle souvent « micro-organes dans une boîte de Pétri ». En utilisant les capacités d'auto-renouvellement, de différenciation et d'auto-organisation des cellules souches, les organoïdes peuvent être cryoconservés pour être utilisés dans des biobanques et peuvent subir une expansion illimitée. Les organoïdes sont très complexes et, comparés aux cellules 2D, ressemblent davantage à l'état in vivo.

Figure 1. Culture d'organoïdes de cellules d'adénocarcinome du côlon humain [1]

Applications des organoïdes

Les organoïdes se distinguent par leur capacité à mieux simuler l'environnement in vivo, ce qui les rend adaptés aux analyses de biologie moléculaire et cellulaire. En comblant le fossé entre les niveaux animal et cellulaire, les organoïdes offrent une solution supérieure pour la recherche dans des domaines tels que les études sur les tumeurs, le criblage de médicaments, la médecine régénérative, etc. Ils ont été largement utilisés dans l'induction fonctionnelle des tissus, l'établissement de modèles de maladies, le criblage de médicaments, les tests anti-inflammatoires, la recherche clinique et divers autres aspects de la recherche, montrant un grand potentiel tant dans la recherche fondamentale que dans les applications translationnelles.

À mesure que les systèmes de culture d'organoïdes et les techniques expérimentales continuent d'évoluer, les organoïdes ont été utilisés pour divers tissus et organes, notamment les intestins (intestin grêle/côlon), l'estomac, le foie, le cœur, les poumons, la prostate, le pancréas, les reins, les seins, les structures semblables au cerveau, la rétine, l'oreille interne, etc.

Les organoïdes dérivés de cellules souches tumorales ont montré un potentiel significatif pour comprendre les mécanismes d'apparition et de développement des tumeurs, évaluer la sensibilité aux médicaments et promouvoir la médecine de précision et le diagnostic personnalisé. Plusieurs articles de Cell and Science indiquent que les organoïdes présentent une sensibilité et une spécificité élevées pour prédire l'efficacité des médicaments anticancéreux. Récemment, les organoïdes tumoraux ont démontré leur rôle dans la prédiction des réponses des patients aux médicaments contre le cancer et dans l'aide à la formulation de plans de traitement personnalisés.

Recherche sur les mécanismes de développement : les capacités de différenciation des organoïdes les rendent adaptés à l'étude des processus et mécanismes de développement embryonnaire. Les processus d'induction régulés par des voies de signalisation telles que Wnt et BMP peuvent être utilisés pour étudier le développement d'organes comme le cerveau, le pancréas et l'estomac [2][3][4].

Mise en place de modèles de lésions de maladies : les organoïdes induits à partir de tissus ou d'organes spécifiques peuvent être utilisés pour étudier des modèles de maladies spécifiques. Les équipes dirigées par Zhao Bing et Lin Xinhua ont utilisé des modèles d'infection organoïde humaine pour étudier les mécanismes moléculaires de l'infection par le SARS-CoV-2 et des lésions hépatiques, fournissant des outils cruciaux pour la recherche sur les mécanismes pathogéniques du virus et le développement ultérieur de médicaments [5]. Le groupe de recherche dirigé par Deng Hongkui de l'École des sciences de la vie de l'Université de Pékin a utilisé de petites molécules et des cytokines pour stimuler la construction d'un nouvel organoïde intestinal présentant des caractéristiques de régénération des dommages : l'hyperorganoïde.Cet organoïde peut être transmis et amplifié pendant une période prolongée, maintenant le génome et favorisant la réparation des lésions tissulaires du côlon, atténuant les symptômes pathologiques dans un modèle animal de colite aiguë, et plus encore [6].

Médecine régénérative : les organoïdes dérivés de cellules souches peuvent réparer ou remplacer les tissus endommagés ou malades pour restaurer la fonction tissulaire normale. Ils ont de nombreuses applications en thérapie cellulaire, notamment pour d'autres maladies neurodégénératives, le diabète, les maladies cardiovasculaires, les troubles rétiniens, les lésions de la moelle épinière, etc. En tant que nouveau traitement dans le domaine de la médecine régénérative, DA01, utilisant de petites molécules comme SB-431542, LDN193189, CHIR-99021, Y-27632 et la protéine Sonic Hedgehog (Shh), stimule les cellules souches pluripotentes à se différencier en neurones dopaminergiques. Ces neurones sont ensuite transplantés dans les zones lésées du cerveau des patients atteints de la maladie de Parkinson à un stade avancé, offrant une nouvelle direction et une nouvelle approche pour le traitement de la maladie [7].

Tests de toxicité et d'efficacité des médicaments : les organoïdes peuvent être utilisés pour vérifier la pharmacotoxicité de nouveaux médicaments dans des organes ou des tissus spécifiques, fournissant ainsi des données à l'appui du développement de nouveaux médicaments. L'utilisation d'organoïdes rénaux Hyman pour vérifier la toxicité rénale du cisplatine en est un exemple [8].

Dépistage de médicaments : les organoïdes dérivés de cellules souches peuvent être utilisés pour tester in vitro les réactions aux médicaments, fournissant ainsi un support théorique au dépistage de médicaments. Les organoïdes du côlon peuvent être utilisés pour étudier les plans de traitement des patients porteurs de mutations CFTR, et les organoïdes tumoraux peuvent être utilisés pour évaluer les situations de traitement individualisées des patients [9].

Histoire du développement des organoïdes

Sources d'organoïdes

Les organoïdes normaux proviennent principalement de cellules souches, notamment de cellules souches pluripotentes (CSP) et de cellules souches adultes (CSA). Les cellules souches pluripotentes comprennent les cellules souches embryonnaires (CSE) et les cellules souches pluripotentes induites (CSPi). Par rapport aux cellules souches pluripotentes, les cellules souches adultes ont l'avantage d'être plus simples et plus rapides à modéliser, mais l'inconvénient de construire des structures organoïdes relativement plus simples. Les structures organoïdes construites à partir de cellules souches pluripotentes sont plus complexes.

Produits utilisés dans Culture d'organoïdes

Petites molécules couramment utilisées dans la culture des organoïdes (résumé) : Super pratique, n'oubliez pas de le mettre dans vos favoris !

❶ Y-27632 (Cat#53006ES, Cat#52604ES) : Un puissant inhibiteur de Rock, inhibant de manière compétitive p160ROCK (Ki = 140 nM) et ROCK-II (IC50 = 800 nM) par compétition ATP.Il inhibe également la PRK2 (IC50 = 600 nM). Généralement ajouté lors du premier ensemencement dans la culture en plaque ; les changements de milieu ultérieurs peuvent ne pas nécessiter d'ajout. Le traitement des cellules souches embryonnaires humaines avec Y-27632 (10 µM) pendant 1 h peut inhiber l'apoptose, augmenter l'efficacité du clonage et prolonger les passages cellulaires.

Concentration de travail recommandée : 10 μM

❷ SB-202190 (Cat#53005ES) : Un inhibiteur efficace de la p38 MAPK kinase, ciblant p38α/β. Le SB202190 peut induire la différenciation des cellules souches embryonnaires humaines en cellules musculaires cardiaques, favoriser l'auto-renouvellement des cellules souches neurales et est applicable à la culture d'organoïdes gastro-intestinaux et mammaires.

Concentration de dissolution recommandée : dissoudre 10 mg dans 3,018 mL de DMSO pour obtenir une solution de 10 mM ; conserver à -20℃.

Concentration de travail recommandée : 10 μM

❸ CHIR-99021 (Cat#53003ES) : un dérivé d'aminopyrimidine, agissant comme inhibiteur de GSK-3 (GSK3α/β). Il induit la différenciation des cellules souches embryonnaires humaines dans l'endoderme et est utilisé dans les cultures d'organoïdes rétiniens et rétiniens. CHIR-99021, lorsqu'il est utilisé en association avec d'autres réactifs, stimule la reprogrammation des cellules somatiques en cellules souches.

Concentration de dissolution recommandée : dissoudre 5 mg dans 3,58 mL de DMSO pour obtenir une solution de 3 mM ; conserver à -20℃.

Concentration de travail recommandée : 3 μM

❹ A 83-01 (Cat#53002ES) : Inhibiteur de la voie Activine/NODAL/TGF-β, inhibant l'activité de la kinase ALK5/4/7. Généralement utilisé dans la culture d'organoïdes du foie, de la prostate et des glandes mammaires. Il est couramment utilisé pour inhiber la différenciation des cellules souches pluripotentes induites (iPSC) et maintenir l'auto-renouvellement des cellules in vitro.

Concentration de dissolution recommandée : dissoudre 5 mg dans 5,93 ml de DMSO pour obtenir une solution à 2 mM ; conserver à -20 °C. (Remarque : ce produit est instable en solution et il est recommandé de l'utiliser immédiatement après sa préparation.)

Concentration de travail recommandée : 2 μM

❺ Gastrine I (Cat#53007ES) : La gastrine est une hormone peptidique gastro-intestinale endogène qui stimule les cellules de la paroi gastrique à sécréter de l'acide gastrique. Elle est essentielle pour les études sur les organoïdes gastro-intestinaux. Lors de la culture d'organoïdes intestinaux et hépatiques, l'ajout de gastrine permet de prolonger la durée de survie des organoïdes.

Concentration de dissolution recommandée : dissoudre 1 mg dans 2,38 mL de solution d'ammoniaque à 1 % pour obtenir une solution de 0,2 mM ; conserver à -20℃.

Concentration de travail recommandée : 10 nM

❻ Nicotinamide (Cat#51402ES) : La nicotinamide, une vitamine B3, participe à diverses réactions d'oxydoréduction enzymatiques et est utilisée dans la culture d'organoïdes gastro-intestinaux, hépatiques et mammaires. La nicotinamide, en association avec des cytokines et d'autres réactifs biochimiques, présente des propriétés anti-inflammatoires, favorise la différenciation des cellules souches mésenchymateuses en cellules productrices d'insuline, inhibe l'activité des sirtuines et est utilisée pour favoriser la formation d'organoïdes et prolonger la durée de vie des organoïdes.

Concentration de dissolution recommandée : dissoudre 100 mg dans 8,19 mL de H2O (ou DMSO) pour obtenir une solution à 100 mM ; conserver à -20℃.

Concentration de travail recommandée : 10 mM

❼ Forskoline (Cat#51001ES) : La forskoline peut activer l'adénylate cyclase, couramment utilisée pour augmenter les niveaux d'AMPc intracellulaire. La forskoline induit la différenciation de divers types de cellules, active le PXR et le FXR et a des effets antiagrégants plaquettaires et antihypertenseurs. Lors de la culture d'organoïdes hépatiques, il est essentiel d'ajouter cette substance.

Concentration de travail recommandée : 1-10 μM

❽ Prostaglandine E2 (Cat#60810ES) : La prostaglandine E2 (PGE2) régule de nombreux systèmes physiologiques, en intervenant dans la prolifération et la différenciation cellulaires.Il est nécessaire lors de la culture d’organoïdes hépatiques et prostatiques et est associé à la relaxation des muscles lisses, à l’inflammation, à la reproduction, à la régulation du cycle du sommeil et à l’intégrité de la muqueuse gastrique.

Concentration de dissolution recommandée : dissoudre 1 mg dans 0,28 mL de DMSO pour obtenir une solution de 10 mM ; conserver à -20℃.

Concentration de travail recommandée : 500 nM

❾ N-acétyl-L-cystéine (Cat#50303ES) : La N-acétyl-L-cystéine (NAC) est un précurseur du glutathion antioxydant, avec des effets antioxydants et inhibiteurs des ROS. Elle inhibe l'apoptose des cellules neuronales et est nécessaire au processus de culture de la plupart des organoïdes.

Concentration de dissolution recommandée : dissoudre 2 g dans 24,51 mL de H2O (ou DMSO) pour obtenir une solution de 500 mM ; conserver à -20℃.

Concentration de travail recommandée : 1 mM

Informations sur les produits associés

Références :

[1] Sato T, Stange DE, et al.Expansion à long terme des organoïdes épithéliaux du côlon humain, de l'adénome, de l'adénocarcinome et de l'épithélium de Barrett. Gastroentérologie. 2011 nov;141(5):1762-72. doi: 10.1053/j.gastro.2011.07.050. Publication en ligne le 2 septembre 2011. PMID: 21889923.

[2] Lancaster MA, Renner M, et al. Les organoïdes cérébraux modélisent le développement du cerveau humain et la microcéphalie. Nature. 2013.501(7467):373-379. http://dx.doi.org/10.1038/nature12517.

[3] Greggio C, et al. Des niches artificielles tridimensionnelles déconstruisent le développement du pancréas in vitro. Développement. 2013.140(21):4452-4462. http://dx.doi.org/10.1242/dev.096628.

[4] McCracken KW, et al. Modélisation du développement humain et de la maladie dans les organoïdes gastriques dérivés de cellules souches pluripotentes. Nature. 2014.516(7531):400-404. http://dx.doi.org/10.1038/nature13863.

[5] Zhao B, Ni C, et al. Récapitulation de l'infection par le SARS-CoV-2 et des lésions des cholangiocytes avec des organoïdes canalaires hépatiques humains. Protein Cell. 2020 octobre ;11(10) :771-775. doi : 10.1007/s13238-020-00718-6. PMID : 32303993 ; PMCID : PMC7164704.

[6] Qu M, Xiong L, et al. Établissement de cultures d'organoïdes intestinaux modélisant la régénération épithéliale associée aux lésions. Cell Res. 2021 mars ;31(3) :259-271. doi : 10.1038/s41422-020-00453-x. Publication en ligne du 8 janvier 2021. PMID : 33420425 ; PMCID : PMC8027647.

[7] BlueRock Therapeutics annonce le premier patient ayant reçu une dose de DA01 dans le cadre d'une étude de phase 1 chez des patients atteints de la maladie de Parkinson à un stade avancé. Communiqué de presse de BlueRock Therapeutics : 8 juin 2021.

[8] Takasato M, Er PX, et al. Les organoïdes rénaux issus de cellules iPS humaines contiennent de multiples lignées et modélisent la néphrogénèse humaine. Nature. 2015.526(7574):564-568. http://dx.doi.org/10.1038/nature15695.

[9] Spence JR, Mayhew CN, et al. Différenciation dirigée de cellules souches pluripotentes humaines dans le tissu intestinal in vitro. Nature. 2011.470(7332):105-109. http://dx.doi.org/10.1038/nature09691.