Le kit d'analyse des fragments d'ADN résiduels des cellules hôtes HEK293 est conçu pour Analyse quantitative des fragments d'ADN résiduels HEK293 de différentes longueurs dans les produits intermédiaires, semi-finis et produits finis de préparations biologiques. Ce kit utilise le principe de la sonde de fluorescence qPCR pour détecter spécifiquement et rapidement les résidus d'ADN HEK293 inférieurs et supérieurs à 200 paires de bases, avec une limite de quantification aussi basse que 10 fg/μL. Il comprend également le contrôle ADN HEK293 (référence quantitative ADN). Ce kit peut être utilisé en conjonction avec les kits de préparation d'échantillons d'ADN résiduel à base de billes magnétiques de la société (N° de référence 18461ES(/18462ES).

Informations sur le produit

Composant

Stockage et expédition :

1. Tous les composants sont expédiés sur de la glace sèche et doivent être stockés entre -25°C et -15°C dès réception. La durée de conservation est de 2 ans. Les composants A et B1, B2, B3 et B4 doivent être conservés à l'abri de la lumière.

2. Dès réception, vérifiez que les 7 composants sont présents et conservez-les immédiatement aux températures recommandées.

Précautions:

1. Ce produit est destiné à des fins de recherche uniquement.

2. Pour des raisons de sécurité et de santé, veuillez porter des blouses de laboratoire et des gants jetables pendant l'opération.

3. Avant d'utiliser ce réactif, lisez attentivement le manuel d'instructions. Les expériences doivent être menées conformément aux procédures standard, y compris la manipulation des échantillons, la préparation des mélanges réactionnels et le pipetage.

4. Chaque composant doit être soigneusement mélangé en agitant doucement et brièvement centrifugé avant utilisation.

Instruments compatibles :

Y compris, mais sans s'y limiter, les instruments suivants : Thermo Scientific : ABI 7500, ABI Quant Studio 5, ABI Step OnePlus, Bio-Rad : module optique CFX96, Technologie médicale de Shanghai Hongshi : SLAN-96S

Mode d'emploi

1. Dilution de la référence quantitative de contrôle ADN HEK293 et ​​préparation des courbes standard

Le kit d'analyse de fragments HEK293 comprend quatre fragments d'amplification de différentes longueurs : 82 pb, 133 pb, 227 pb et 515 pb. Lors de l'établissement de courbes standard, configurez des courbes distinctes pour chaque fragment d'amplification et calculez leurs quantités résiduelles et leurs distributions relatives en fonction des courbes standard correspondantes.

Utilisez le tampon de dilution d'ADN fourni dans le kit pour effectuer une dilution en gradient de la référence quantitative de contrôle d'ADN HEK293. Les concentrations de dilution doivent être les suivantes : 3 ng/μL, 300 pg/μL, 30 pg/μL, 3 pg/μL, 300 fg/μL et 30 fg/μL.

Les détails sont les suivants

1). Placez le contrôle ADN HEK293 et ​​le tampon de dilution ADN du kit sur de la glace pour les décongeler. Après décongélation complète, vortexez doucement pour mélanger et centrifugez brièvement (10 secondes) pour recueillir la solution au fond du tube.

2)Préparez six tubes à centrifuger propres de 1,5 ml et étiquetez-les comme Std0, Std1, Std2, Std3, Std4 et Std5.

3). Dans le tube étiqueté Std0, ajouter 90 μL de tampon de dilution d'ADN et 10 μL de contrôle d'ADN HEK293 pour obtenir une concentration de 3 ng/μL. Vortexer doucement pour mélanger et centrifuger brièvement (10 secondes). Cette concentration peut être aliquotée et conservée à -20°C pour une utilisation à court terme (jusqu'à 3 mois). Éviter les cycles répétés de congélation-décongélation.

4). Dans les tubes étiquetés Std0, Std1, Std2, Std3, Std4 et Std5, ajoutez d'abord 90 μl de tampon de dilution d'ADN à chacun. Chaque étape de dilution doit être mélangée doucement et centrifugée brièvement pour assurer l'uniformité. Ensuite, effectuez le dégradé dilutions comme suit :

Tableau 1 : Dilution du gradient standard

* Pour chaque concentration, effectuez 3 répétitions. Ce réactif peut effectuer des tests dans une plage linéaire de 300 pg/μL à 30 fg/μL. Si nécessaire, la plage linéaire peut être étendue ou réduite de manière appropriée.

** Pour réduire les cycles répétés de congélation-décongélation et éviter la contamination, il est recommandé d'aliquoter et de stocker la quantification de l'ADN mnorme à -20°C pour la première utilisation.

*** La dilution d'ADN décongelée non utilisée peut être conservée à 2-8°C pendant 7 jours maximum. Si elle n'est pas utilisée pendant une période prolongée, conservez-la à -20°C.

**** Pour assurer un mélange complet du modèle, agitez doucement chaque dilution de gradient pendant environ 1 minute.

2. Préparation de l'échantillon d'essai (TS)

Préparez l'échantillon d'essai TS conformément au dispositif expérimental, comme suit :

1) Prenez 100 μL de l'échantillon d'essai et ajoutez-le à un tube à centrifuger propre de 1,5 mL. Étiquetez-le comme TS, effectuez le prétraitement de l'échantillon et préparez le tube.ou purifet le échantillon d'essai.

2) Pour répondre à l'exigence d'analyse simultanée de quatre longueurs d'extension différentes, la quantité d'échantillon d'essai prétraité doit être ≥ 120 μL. Par conséquent, il est recommandé de préparer 2 tubes de chaque échantillon pour le prétraitement et, après l'extraction, de les mélanger pour l'utilisation.

3. Préparation du contrôle d'extraction négatif (NCS)

Préparez le contrôle d'extraction négatif NCS conformément à la configuration expérimentale, comme suit :

1) Prélevez 100 μL de la solution de matrice d'échantillon (ou de dilution d'ADN) tampon) et ajoutez-le à un tube à centrifuger propre de 1,5 ml. Étiquetez-le comme NCS.

2) Effectuez le prétraitement de l'échantillon du contrôle négatif NCS avec le lot d'échantillons de test et préparez la solution de contrôle négatif NCS purifiée.

3) Pour répondre à l'exigence d'analyse simultanée de quatre longueurs d'extension différentes, la quantité d'échantillon NCS prétraité doit être ≥ 120 μL. Par conséquent, il est recommandé de préparer 2 tubes de chaque échantillon NCS pour le prétraitement et, après l'extraction, de les mélanger pour l'utilisation.

4. Préparation du contrôle sans gabarit (NTC)

Préparez le NTC témoin sans modèle conformément à la configuration expérimentale, comme suit :

1) Le contrôle sans modèle (NTC) ne nécessite pas d'échantillon prétraitement, et peut être préparé à partir de l'étape de détection du contenu résiduel d'ADN à l'aide de la qPCR.

2) Pour chaque tube ou puits, l'échantillon NTC est composé de 20 μL de mélange (soit 15 μL de mélange qPCR HEK293 + 5 μL de mélange d'amorces et de sondes HEK293 correspondant) + 10 μL de tampon de dilution d'ADN. Il est recommandé de préparer suffisamment de mélange pour 3 puits répliqués.

5. Système de réaction qPCR

Tableau 2. Système de réaction pour Fragment de 82 pb

Tableau 3. Système de réaction pour 133 fragment de pb

Tableau 4. Système de réaction pour 227 fragment de pb

Tableau 5. Système de réaction pour 515 fragment de pb

* Pour calculer la quantité totale de mélange nécessaire à cette réaction en fonction du nombre de puits :

Mélange = (nombre de puits de réaction + 2) × (15 + 5) μL (pour tenir compte de la perte des 2 puits). En général, 3 puits répliqués sont préparés pour chaque échantillon.

** Nombre de puits de réaction = (5 puits de courbe standard de gradient de concentration + 1 contrôle sans modèle (NTC) + 1 solution de contrôle négatif (NCS) + N échantillons de test (TS)) × 3.

NTC (contrôle sans modèle) : tampon de dilution d'ADN

NCS (solution de contrôle négatif) : solution de matrice d'échantillon ou tampon de dilution d'ADN après pré-échantillonnage-traitement pour obtenir la solution purifiée, qui est le NCS.

TS (Test Sample) : L'échantillon à tester.

***Après avoir distribué les échantillons et scellé les tubes, centrifuger brièvement à basse vitesse (10 secondes) pour recueillir le liquide des parois du tube vers le fond. Vortexer ensuite pendant au moins 5 secondes pour bien mélanger. Ensuite, effectuer une autre centrifugation à basse vitesse (10 secondes). S'il y a des bulles, veillez à les éliminer.

Tableau 6 : Disposition de la plaque de référence

Cet exemple montreril s'agit de la procédure de détection qPCR pour l'analyse des fragments d'amplification de l'ADN HEK293 résiduel.Les échantillons de test comprennent : 5 gradients de concentration de la courbe standard d'ADN HEK293, 1 échantillon de test (TS), 1 solution de contrôle négatif (NCS) et 1 contrôle sans matrice (NTC). Il est recommandé d'effectuer 3 puits répliqués pour chaque échantillon.

6. Paramètres du programme d'amplification (Ttrois-Méthode étape par étape) (Exemple utilisant l'instrument ABI 7500 qPCR, version logicielle 2.0)**

1) Créez un nouveau programme vierge et sélectionnez « Quantification absolue » comme modèle de détection.

2) Pour les quatre longueurs de fragments d'amplification différentes, créez de nouvelles sondes de détection en les nommant « HEK293-82 », « HEK293-133 », « HEK293-227 » et « HEK293-515 ». Sélectionnez le fluorophore rapporteur comme « FAM » et le fluorophore extincteur comme « aucun ». Définissez le colorant de référence pour la détection comme « ROX » (le colorant de référence peut être ajouté ou non en fonction du modèle d'instrument et d'autres facteurs).

3) Dans le panneau « Assign target(s) to the selected wells », définissez le champ « Task » pour les puits de courbe standard sur « Standard », et attribuez les valeurs correspondantes dans le champ « Quantity » sur « 300000 », « 30000 », « 3000 », « 300 », « 30 » (représentant la concentration d'ADN par puits, en fg/μL). Nommez les puits dans le champ « Sample Name » sur « 300 pg/μL », « 30 pg/μL », « 3 pg/μL », « 300 fg/μL », « 30 fg/μL ». Pour les puits NTC, définissez la « Task » sur « NTC ». Pour les puits NCS et TS, définissez la « Task » sur « Unknown », et nommez les puits « NCS » et « TS » dans le champ « Sample Name ». Après avoir défini ces paramètres, cliquez sur « Démarrer l'exécution » pour lancer l'exécution de l'instrument.

4) Paramètres du programme d'amplification : définissez le programme d'amplification en trois étapes, avec un volume de réaction de 30 μL.

Tableau7. Procédure PCR

7. Analyse des résultats de la qPCR

1) Dans le panneau « Analyse » sous « Graphique d'amplification », le système définit automatiquement le « seuil ». Parfois, le « seuil » par défaut est trop proche de la ligne de base, ce qui entraîne une variation significative du Ct entre les réplications. Vous pouvez ajuster manuellement le « seuil » à une position appropriée et cliquer sur « Analyser ». À ce stade, vous pouvez vérifier de manière préliminaire les courbes d'amplification dans le « Graphique multicomposant » pour voir si elles sont normales.

2) Dans le panneau « Analyse » sous « Courbe standard », vous pouvez lire le R² de la courbe standard, l'efficacité d'amplification (Eff%), la pente et l'intercept. Pour une courbe standard normale : R² > 0,99, efficacité d'amplification (90 % ≤ Eff% ≤ 110 %), et pente entre -3,6 et -3,1.

3) Dans le panneau « Analyse » sous « Afficher le tableau des puits », vous pouvez lire la colonne « Quantité » pour le contrôle sans modèle (NTC), le contrôle négatif (NCS) et les échantillons de test (TS), avec l'unité en fg/μL. Les unités peuvent être converties ultérieurement dans le rapport.

4) Les paramètres d'analyse des résultats doivent être définis en fonction du modèle d'instrument et de la version du logiciel. En règle générale, l'instrument peut interpréter automatiquement les résultats.

5) La valeur Ct du contrôle négatif (NCS) doit être supérieure à la valeur Ct moyenne de la concentration la plus faible de la courbe standard.

6) Le résultat du contrôle sans modèle (NTC) doit être « Indéterminé » ou avoir une valeur Ct ≥ 32.

Document

Manuel