प्रिय मित्रों, क्या आप प्रोटीन इम्यूनोब्लॉटिंग के दौरान विभिन्न लोडिंग कंट्रोल और एपिटोप टैगिंग एंटीबॉडी का सामना करते समय असमंजस में महसूस करते हैं? लोडिंग कंट्रोल प्रोटीन जीवों में हाउसकीपिंग जीन द्वारा एनकोड किए जाते हैं और कई ऊतकों में स्थिर रूप से व्यक्त किए जाते हैं। उनका उपयोग यह सत्यापित करने के लिए किया जाता है कि क्या प्रतिरक्षात्मक प्रयोग सामान्य रूप से आगे बढ़ रहे हैं और प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए अर्ध-मात्रात्मक पहचान मानक के रूप में। तो, आप लोडिंग कंट्रोल एंटीबॉडी को सही तरीके से कैसे चुनते हैं? आप निम्नलिखित बिंदुओं का संदर्भ ले सकते हैं।
I. नमूना प्रजाति की उत्पत्ति
- स्तनधारी ऊतकों या कोशिकाओं से नमूने के लिए, आमतौर पर β-एक्टिन, α-ट्यूबुलिन, GAPDH, लेमिन-बी, हिस्टोन H3, Na+/K+-ATPase चुनें।
- पौधों से प्राप्त नमूनों के लिए, आमतौर पर प्लांट एक्टिन, रूबिस्को आदि का चयन करें।
- कम शोध वाले अन्य नमूनों के लिए, प्रासंगिक साहित्य या डेटाबेस से परामर्श करके आंतरिक संदर्भ के रूप में उपयुक्त प्रोटीन का चयन करें।
सुनिश्चित करें कि लक्ष्य प्रोटीन का आणविक भार लोडिंग नियंत्रण से भिन्न हो पता लगाने के दौरान हस्तक्षेप को रोकने के लिए 5KDa से अधिक। उदाहरण के लिए, यदि लक्ष्य प्रोटीन 40KDa है, तो लोडिंग नियंत्रण के रूप में β-एक्टिन (42KDa) चुनना उपयुक्त नहीं है। लोडिंग नियंत्रण के रूप में GAPDH (36KDa) या β-ट्यूबुलिन (55KDa) का उपयोग करने पर विचार करें।
III. आंतरिक संदर्भ प्रोटीन की अभिव्यक्ति साइट
नोट: उपयोग करते समय निम्नलिखित स्थितियों से बचें लोडिंग नियंत्रण एंटीबॉडी
| उपकोशिकीय स्थानीयकरण | लोडिंग नियंत्रण प्रोटीन | आणविक भार (केडीए) | नोट्स |
| कोशिकाद्रव्य, संपूर्ण कोशिका | β-एक्टिन | 42 | परमाणु अर्क के लिए उपयुक्त नहीं है। β-एक्टिन क्रोमेटिन रीमॉडलिंग कॉम्प्लेक्स का एक घटक है; उन स्थितियों के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है जहां शोध विषयों के बीच महत्वपूर्ण आयु अंतर हैं। |
| α ट्यूबिलिन | 55 | उन स्थितियों के लिए उपयुक्त नहीं है जहाँ शोध विषयों के बीच महत्वपूर्ण आयु अंतर हैं। ट्यूबुलिन की अभिव्यक्ति रोगाणुरोधी और एंटीमाइटोटिक दवाओं के साथ बदलती है, इसलिए यह एंटीकैंसर और एंटीफंगल दवाओं को जोड़ते समय उपयुक्त नहीं है। | |
| β ट्यूबिलिन | 55 | ||
| GAPDH | 36 | सेल हाइपोक्सिया के कारण GAPDH की अभिव्यक्ति बढ़ जाएगी, इसलिए यह ऑक्सीजन से संबंधित अध्ययनों के लिए उपयुक्त नहीं है। मधुमेह जैसे कारक GAPDH की अभिव्यक्ति को बढ़ा सकते हैं। | |
| विंकुलिन | 117 | बड़े आणविक भार प्रोटीन के लिए संदर्भित किया जा सकता है। | |
| माइटोकॉन्ड्रिया | कॉक्सिव श्रृंखला | 15-17 | प्रोटीन की यह श्रृंखला मुख्य रूप से 15-17KDa पर केंद्रित होती है। यदि लक्ष्य प्रोटीन आणविक भार करीब है, तो अन्य लोडिंग नियंत्रण एंटीबॉडी पर विचार करें। |
| एचएसपी60 | 60 |
| |
| नाभिक | वीडीएसी1/2 | 31-37 | प्रोटीन की यह श्रृंखला मुख्य रूप से 31-37KDa पर केंद्रित होती है। |
| लैमिन बी1 | 66 | भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के लिए उपयुक्त नहीं है, लोडिंग नियंत्रण के रूप में उपयुक्त नहीं है एपोप्टोसिस प्रयोगों में. | |
| पीसीएनए | 36 | गैर-प्रसारित कोशिकाओं के लिए उपयुक्त नहीं है। | |
| टीबीपी | 33-43 | टीबीपी मनुष्यों में 37-43KDa और चूहों में 33-36KDa है, जो एपोप्टोसिस प्रयोगों के लिए उपयुक्त नहीं है। | |
| वर्ष 1 | 65-70 |
| |
| हिस्टोन H3 | 17 | अधिकांश प्रोटीन का आणविक भार लगभग 17KDa होता है। यदि लक्ष्य प्रोटीन का आणविक भार करीब है, तो अन्य लोडोंग नियंत्रण एंटीबॉडी पर विचार करें। | |
| संपूर्ण रक्त, सीरम, प्लाज्मा | ट्रांसफ़रिन | 77 | अभिव्यक्ति कुछ रोग स्थितियों और उपचारों, जैसे रेटिनोइक एसिड, से प्रभावित होती है। |
| एल्बुमिन | 66 | सामग्री अत्यंत उच्च है, WB प्रयोगों में नमूना लोडिंग को कम करने पर ध्यान दें। |
लेबल एंटीबॉडी एक साथ उपयोग किए जाने पर बेहतर काम करते हैं
प्रोटीन इंटरैक्शन का अध्ययन करने वाले प्रयोगों में, जैसे कि पुल-डाउन, एपिटोप टैग को आणविक जैविक तरीकों के माध्यम से लक्ष्य प्रोटीन के एन या सी टर्मिनस में जोड़ा जा सकता है। आम तौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले एपिटोप टैग में हिस, एचए, मायक और जीएसटी शामिल हैं। ये एपिटोप टैग आमतौर पर लक्ष्य प्रोटीन की जैविक गतिविधि और इंट्रासेल्युलर स्थानीयकरण को प्रभावित नहीं करते हैं। एपिटोप टैग के उद्भव ने वैज्ञानिक अनुसंधान और औद्योगिक उत्पादन के लिए सुविधा प्रदान की है।
| एपिटोप टैग | टैग अनुक्रम | आणविक वजन (केडीए) |
| एचए टैग | YPYDVPDYA | 1.1 |
| माईक टैग | EQKLISEEDL | 1.2 |
| ध्वज टैग | डीवाईकेडीडीडीके | 1 |
| जीएसटी टैग | - | 26 |
| जीएफपी टैग | - | 26.9 |
| V5 टैग | जीकेपीआईपीएनपीएलएलजीएलडीएस | 1.4 |
| एस-टैग | केताआकफरक्यूएचएमडीएस | 1.8 |
| ई-टैग | GAPVPYPDPLEPR | 1.4 |
उत्पाद की जानकारी
| प्रकार | प्रोडक्ट का नाम | आणविक वजन (केडीए) | उत्पाद संख्या |
| लोडिंग नियंत्रण एंटीबॉडी | β-एक्टिन, माउस mAb | 42 | 30101ईएस |
| β-एक्टिन, खरगोश pAb | 42 | 30102ईएस | |
| GAPDH (क्लोन:1A6), माउस mAb | 36 | 30201ईएस | |
| GAPDH, खरगोश pAb | 36 | 30202ईएस | |
| α-ट्यूबुलिन, माउस mAb | 50-55 | 30304ईएस | |
| β-ट्यूबुलिन, माउस mAb | 50-55 | 30301ईएस | |
| β-ट्यूबुलिन, खरगोश pAb | 50-55 | 30302ईएस |