1 जेनेटोमाइसिन की क्रिया का सिद्धांत

जेनेटोमाइसिन (जेनेटिसिन, G418) एक एमिनोग्लाइकोसाइड एंटीबायोटिक है जो प्रोकैरियोटिक और यूकेरियोटिक कोशिकाओं में 70S और 80S राइबोसोम से बंध कर पेप्टाइड श्रृंखला विस्तार को अवरुद्ध करके प्रोटीन संश्लेषण को रोकता है। यह तंत्र बैक्टीरिया, खमीर, पौधों और स्तनधारी कोशिकाओं सहित उन लोगों के लिए विषाक्त है। जब कोशिकाओं को सफलतापूर्वक ट्रांसफ़ेक्ट किया गया और नियोमाइसिन प्रतिरोध जीन (जैसे नियो जीन) के साथ एकीकृत किया गया, तो जीन-एनकोडेड एमिनोग्लाइकोसाइड फॉस्फोट्रांसफेरेज़ (APH (3) II) G418 को निष्क्रिय करने के लिए सहसंयोजक रूप से संशोधित कर सकता है, जिससे G418 युक्त चयनात्मक माध्यम में विकसित कोशिकाओं को प्रतिरोध प्रदान किया जा सकता है।

आणविक आनुवंशिक परीक्षणों में, G418 स्थिर ट्रांसफ़ेक्शन के लिए आमतौर पर उपयोग किया जाने वाला एक परीक्षण है।

2 जीनोमाइसिन का अनुप्रयोग

2.1 स्थिर ट्रांसफ़ेक्टेड सेल लाइनों की स्क्रीनिंग

• G418 का उपयोग प्रोटीन संश्लेषण को बाधित करके प्रतिरोधी जीन (जैसे, नियो जीन) युक्त कोशिकाओं की जांच करने के लिए किया गया था। प्रतिरोधी जीन द्वारा एन्कोड किया गया एमिनोग्लाइकोसाइड फॉस्फोट्रांसफेरेज G418 को निष्क्रिय कर देता है, जो G418 को कोशिका प्रतिरोध प्रदान करता है। आम तौर पर, स्तनधारी कोशिका स्क्रीनिंग रेंज 200 - 2000 μg/mL होती है, जिसमें सबसे अधिक इस्तेमाल की जाने वाली कार्यशील सांद्रता 100 - 700 μ g / mL होती है। जहाँ पादप कोशिकाएँ 10-100 μg/mL होती हैं और खमीर कोशिकाएँ 500-1000 μ g / mL होती हैं, संदर्भ के लिए G418 का उपयोग करके कुछ कोशिका प्रकारों के लिए निम्नलिखित सांद्रताएँ उपयोग की जाती हैं।

कक्ष	आवेदन	जीनोमाइसिन की सक्रियण सांद्रता(μg/mL)	उद्धृत कार्य
म्यूकर प्रजाति	a) विकास माध्यम में संवर्धित b) लाइओफिलाइज़्ड बैक्टीरिया पर संवर्धित	ए) 10 μg/एमएल बी) 30 माइक्रोग्राम/एमएल	हिर्थ, एट अल., प्रोक. नेशनल एकेड. साइंस., 79, 7356-7360 (1982).
स्तनधारी	क) स्क्रीनिंग के लिए ख) विकास को बनाए रखने के लिए	ए) 400 -1000 μg/एमएल बी) 200 माइक्रोग्राम/एमएल	कनानी और बर्ग, प्रोक. नेशनल. एकेड. साइंस., 79, 5166-5170 (1982).
पौधा	क) स्क्रीनिंग के लिए ख) विकास को बनाए रखने के लिए	क) 25-50 μg/mL बी) 10 μg/एमएल	उर्सिक, एट अल., बायोकैम. बायोफिज़. रिसर्च. कम्यूनिकेशन, 101:3, 1031-1037 (1981).
यीस्ट	क) स्क्रीनिंग के लिए ख) विकास को बनाए रखने के लिए	ए) 500 μg/एमएल बी) 125-200 μg/mL	जिमेनेज़ और डेविस, प्रकृति, वि. 287, 869-871 (1980).
जीवाणु	स्क्रीनिंग के लिए	16 माइक्रोग्राम/एमएल	वेट्ज, एट अल., रोगाणुरोधी एजेंट कीमोथेरपी, वि. 6:5, 579-581 (1974).

2.2 जीन नॉकआउट और जीन स्थानांतरण

• जीन नॉकआउट में, G418 का उपयोग उन कोशिकाओं की स्क्रीनिंग के लिए किया जा सकता है जो सफलतापूर्वक लक्ष्य जीन को नॉकआउट करती हैं। जीन स्थानांतरण में, G418 मेजबान कोशिकाओं के जीनोम में विदेशी जीन के एकीकरण की सुविधा प्रदान करता है।

2.3 कोशिका संवर्धन में प्रतिरोध चयन

• कोशिका संवर्धन के दौरान, G418 का उपयोग एंटीबायोटिक के प्रति प्रतिरोधी कोशिकाओं की जांच के लिए किया जाता है, जिनमें अक्सर विशिष्ट प्रतिरोधी जीन होते हैं।

3 जीनोमाइसिन के लिए प्रासंगिक प्रयोगात्मक प्रक्रियाएं

3.1 G418 स्टॉक सॉल्यूशन की तैयारी (50 मिलीग्राम/एमएल, सक्रिय सांद्रता)

1) गतिविधि इकाइयों का रूपांतरण

सूत्र का उपयोग करके परिवर्तित करें: (1000/A0) × A1 = A2, जहाँ A0 G418 की शक्ति है, जो बैच के अनुसार भिन्न होती है। संबंधित बैच के लिए गुणवत्ता नियंत्रण रिपोर्ट या बोतल पर लेबल देखें। A1 तैयार किए जाने वाले G418 की वांछित सक्रिय सांद्रता है। A2 वजन किए जाने वाले वास्तविक पाउडर-से-मात्रा सांद्रता है।

उदाहरण के लिए, यदि G418 के बैच की क्षमता 750 U/mg है और आप 50 mg/mL की सक्रिय सांद्रता तैयार करना चाहते हैं, तो तैयार की जाने वाली वास्तविक पाउडर सांद्रता 1000/750 × 50 mg/mL = 66.67 mg/mL है।

यदि 10 एमएल G418 स्टॉक समाधान (सक्रिय सांद्रता, 50 मिलीग्राम/एमएल) तैयार किया जा रहा है, तो 666.7 मिलीग्राम पाउडर की आवश्यकता होगी।

• बंध्यीकरण और भंडारण

उपरोक्त रूपांतरण से प्राप्त वास्तविक पाउडर वजन के आधार पर, इसे पूरी तरह से घुलने के लिए 10 एमएल बाँझ विआयनीकृत पानी में मिलाएं।

सबसे पहले, 0.22 μm सिरिंज फ़िल्टर को 5 mL स्टेराइल डीआयनाइज़्ड पानी से गीला करें, सारा पानी निकाल दें। फिर इस फ़िल्टर का उपयोग करके स्टेरलाइज़ करें और एकल उपयोग के लिए छोटी मात्रा में विभाजित करें (जैसे, 1 mL) और 1 वर्ष की स्थिरता के लिए -20°C पर स्टोर करें।

3.2 किल कर्व की स्थापना

1) पहला दिन: अपरिवर्तित कोशिकाओं को उपयुक्त संवर्धन प्लेटों में 20-25% कोशिका घनत्व पर प्लेट करें और 37°C, CO पर रात भर इनक्यूबेट करें₂.

2) कोशिका प्रकार के आधार पर एक उपयुक्त सीमा के भीतर सांद्रता प्रवणता निर्धारित करें, कम से कम 6 सांद्रता का चयन करें (G418 विभाजन चरण में कोशिकाओं के खिलाफ सबसे अधिक सक्रिय है, इसलिए G418 जोड़ने से पहले कोशिकाओं को एक अवधि के लिए संवर्धित किया जाना चाहिए), उदाहरण के लिए, स्तनधारी कोशिकाओं के लिए, 0, 50, 100, 200, 400, 800, 1000 μg/mL निर्धारित करें।

3) दूसरा दिन: पुराने संवर्धन माध्यम को हटा दें और उसकी जगह ताजा तैयार माध्यम डालें जिसमें दवा की संगत सांद्रता हो, प्रत्येक सांद्रता के लिए तीन प्रतिकृतियां हों।

4) हर 3-4 दिन में ताजा दवा-युक्त माध्यम बदलें।

5) निश्चित अंतराल पर जीवित कोशिकाओं की गणना करें (जैसे, हर 2 दिन में) ताकि उचित सांद्रता निर्धारित की जा सके जो कि असंक्रमित कोशिकाओं की वृद्धि को रोकती है। स्थिर ट्रांसफ़ेक्टेड सेल लाइन स्क्रीनिंग के लिए कार्यशील सांद्रता के रूप में सबसे कम सांद्रता का चयन करें जो आदर्श दिनों (आमतौर पर 7-10 दिन) के भीतर अधिकांश कोशिकाओं को मार सकती है।

3.3 स्थिर ट्रांसफ़ेक्टेड कोशिकाओं की स्क्रीनिंग

• यिशेंग बायोटेक द्वारा उपलब्ध कराए गए G418 जेनेटिसिन (60220ES) की प्रभावकारिता ≥720 U/mg है, शुद्धता ~98% है, तथा बैच स्थिरता है, तथा इसकी कीमत अन्य कंपनियों के G418 उत्पादों की कीमत का लगभग एक तिहाई है।
• दवाइयों से युक्त स्क्रीनिंग माध्यम को हर 3-4 दिन में बदला जाता था।
• सेल क्लोन (कॉलोनी) के निर्माण को चयन के 7 दिनों के बाद देखा और मूल्यांकन किया गया। मेजबान सेल प्रकार, ट्रांसफ़ेक्शन और स्क्रीनिंग प्रभावकारिता के आधार पर कॉलोनियों को बनने में एक सप्ताह या उससे अधिक समय लग सकता है।
• 5-10 प्रतिरोधी क्लोनों को चुनकर 35 मिमी सेल कल्चर प्लेटों में स्थानांतरित किया गया तथा 7 दिनों तक दवा युक्त स्क्रीनिंग माध्यम में रखा गया।
• सामान्य माध्यम संस्कृति को बदलने के बाद।

4 उत्पाद अनुशंसा

जी418 जेनेटिकिन (60220ईएस) येसेन द्वारा प्रदान किया गया बायोटेक की प्रभावकारिता ≥720 U/mg है, शुद्धता ~98% है, तथा बैच स्थिरता है, तथा इसकी कीमत अन्य कम्पनियों के G418 उत्पादों की तुलना में लगभग एक-तिहाई है।

विनिर्देश	एस*	टी*	येसेन	येसेन लाभ
सामग्री (एचपीएलसी)	/	/	~98%	उच्च शुद्धता
क्षमता (यू/एमजी)	≥720 µg/मिलीग्राम	707-721 µg/मिलीग्राम	≥720 µg/मिलीग्राम	उच्च प्रभावशीलता
मूल्य ($/5 ग्राम)	~1000	~1000	~200	सस्तता

5 प्रायोगिक मामला

ई. कोलाई में, G69 और G99 दो अलग-अलग बैच थे; जीनोमाइसिन की सांद्रता क्रमशः 8 मिलीग्राम/लीटर, 12 मिलीग्राम/लीटर और 16 मिलीग्राम/लीटर थी, और प्रभावी न्यूनतम सांद्रता 16 मिलीग्राम/लीटर थी, जिसने विविध बैक्टीरिया के विकास को पूरी तरह से बाधित कर दिया।