1. डेंड्राइटिक कोशिकाएं (डीसी) क्या हैं?
डेंड्राइटिक कोशिकाएं (DCs) मानव शरीर में सबसे प्रभावी एंटीजन प्रेजेंटिंग कोशिकाएं (APCs) हैं। DCs एकमात्र APC हैं जो भोले T कोशिका प्रसार को मजबूती से उत्तेजित करने में सक्षम हैं। अन्य प्रकार के APC (जैसे मोनोसाइट्स, मैक्रोफेज, B कोशिकाएं, आदि) केवल सक्रिय या मेमोरी T कोशिकाओं को उत्तेजित कर सकते हैं। इसलिए, DC कोशिकाएं अनुकूली T कोशिका प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की आरंभकर्ता हैं और ट्यूमर प्रतिरक्षा में एक अत्यंत महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं। DC कोशिकाएं अपनी सतह पर MHC-I और MHC-II अणुओं को अत्यधिक व्यक्त करती हैं और उनके पास विशिष्ट सतह मार्कर होते हैं। वे एंटीजन को सक्रिय करने के लिए T कोशिकाओं को लेते हैं, संसाधित करते हैं और उत्तेजित करते हैं, और अंततः T कोशिकाओं की भेदभाव दिशा निर्धारित करते हैं।
2. डीसी का स्रोत
डीसी कोशिकाएँ शरीर में बहुत कम मात्रा में मौजूद होती हैं। डीसी को शरीर से सीधे अलग करने में बहुत समय लगता है और कोशिका की उपज बहुत कम होती है, जो डीसी के शोध और अनुप्रयोग को बहुत सीमित करती है। हालाँकि, डीसी को विभिन्न ऊतकों में डीसी अग्रदूत कोशिकाओं से विभेदित और प्रेरित किया जा सकता है, जैसे अस्थि मज्जा द्रव में अग्रदूत कोशिकाएँ, परिधीय रक्त और गर्भनाल रक्त में मोनोसाइट्स।
मनुष्यों के लिए, चूँकि मानव परिधीय रक्त प्राप्त करना सबसे सुविधाजनक है और इसमें मोनोसाइट्स की संख्या सबसे अधिक है, इसलिए सबसे अधिक इस्तेमाल की जाने वाली विधि मानव परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (PBMC) से DC प्रेरित करना है। चूहों के लिए, सबसे आम तरीका अस्थि मज्जा कोशिकाओं, अर्थात् अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न डेंड्राइटिक कोशिकाओं (BMDC) से DC प्रेरित करना है।
चित्र 1. क्लासिक BMDC तैयारी विधि का योजनाबद्ध आरेख
3. बीएमडीसी तैयारी विधि
माउस BMDCs तैयार करने की सामान्य विधियाँ हैं:
3.1 शास्त्रीय बीएमडीसी संवर्धन विधि - इनाबा विधि (संशोधित)
3.2 बीएमडीसी की बड़े पैमाने पर तैयारी - संस विधि
3.3 बीएमडीसी की बड़े पैमाने पर तैयारी - लुट्ज़ विधि
3.1 [क्लासिक बीएमडीसी संस्कृति विधि] - इनाबा विधि (सुधारित)
【पृष्ठभूमि】
एक। इनाबा विधि द्वारा प्राप्त बीएमडीसी की संख्या 5-7 x 10 है6/चूहा;
बी। मूल इनाबा विधि केवल BMDCs के उत्पादन को प्रेरित करने के लिए GM-CSF का उपयोग करती है। हालाँकि प्राप्त BMDCs में मिश्रित लिम्फोसाइट प्रतिक्रिया में एक मजबूत उत्तेजक क्षमता होती है, लेकिन DCs की परिपक्वता GM-CSF + IL-4 के संयुक्त प्रेरण की तुलना में उतनी अच्छी नहीं होती है। इसलिए, बाद की बेहतर विधि अक्सर GM-CSF + IL-4 के संयुक्त प्रेरण का उपयोग करती है।
【खेती के चरण】
3.1.1 माउस अस्थि मज्जा कोशिकाओं को प्राप्त करना
1) चूहों (6-10 सप्ताह की आयु) को ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा मार दिया गया, सभी फीमर और टिबिया को शल्य चिकित्सा द्वारा हटा दिया गया, और हड्डियों के आसपास के मांसपेशी ऊतक को कैंची और संदंश की सहायता से यथासंभव हटा दिया गया।
[टिप्पणी] हड्डियों को नुकसान न पहुंचाएं।
2) हड्डी को साफ बेंच पर ले जाएं और इसे कीटाणुरहित करने के लिए 70% अल्कोहल युक्त एक जीवाणुरहित कल्चर डिश में 2-5 मिनट तक भिगोएं, फिर इसे दो बार जीवाणुरहित पीबीएस से धो लें।
3) हड्डी को पीबीएस युक्त एक अन्य नए कल्चर डिश में ले जाएं, कैंची से हड्डी के दोनों सिरों को काटें, और फिर पीबीएस निकालने के लिए एक सिरिंज का उपयोग करें। हड्डी के दोनों सिरों से अस्थि मज्जा गुहा में सुई डालें, और बार-बार अस्थि मज्जा को कल्चर डिश में तब तक फ्लश करें जब तक कि हड्डी पूरी तरह से सफेद न हो जाए।
4) अस्थि मज्जा निलंबन को एकत्रित करें और 200-मेष नायलॉन जाल से छोटे टुकड़ों और मांसपेशी ऊतक को छान लें।
5) छानने वाले पदार्थ को 1200 डिग्री पर अपकेंद्रित्र करें आरपीएम के लिए 5 मिनट और सतह पर तैरने वाले पदार्थ को त्याग दें।
6) 2 मिली अमोनियम क्लोराइड लाल रक्त कोशिका लाइसिस बफर (1x) मिलाएं, कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें, और कमरे के तापमान पर 3-3 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।5 मिनट, 10 तक मि.
7) लाइसिस बफर के प्रभाव को बेअसर करने के लिए 10 मिली पीबीएस मिलाएं, फिर 1200 आरपीएम पर सेंट्रीफ्यूज करें 5 मिनट और सतह पर तैरने वाले पदार्थ को त्याग दें।
8) एक बार PBS से धोएँ, और फिर 10% FBS युक्त RPMI1640 कल्चर माध्यम में कोशिकाओं को फिर से लटकाएँ। माउस अस्थि मज्जा कोशिकाएँ प्राप्त की गई हैं।
अमोनियम क्लोराइड लाल रक्त कोशिका लिसिस समाधान की तैयारी:
एक। 10x भंडारण घोल इस प्रकार तैयार करें: वजन 82.9 जी एनएच4Cl, 10.0 ग्राम KHCO3 और 0.37 ग्राम Na2EDTA, 1L आसुत जल में घोलें, 0.22 से छानें μm फिल्टर झिल्ली को जीवाणुरहित करें, और 6 महीने के लिए 4℃ पर स्टोर करें;
बी। उपयोग से पहले, 10x भंडारण घोल को बाँझ आसुत जल 1:9 के साथ 1x कार्यशील घोल में पतला करें।
[टिप्पणी] क्योंकि अमोनियम क्लोराइड लाल रक्त कोशिका लिसिस समाधान का अस्थि मज्जा कोशिकाओं पर एक निश्चित हानिकारक प्रभाव होता है, इसलिए हेमोलिसिस समय को जितना संभव हो उतना छोटा किया जाना चाहिए।
3.1.2 बीएमडीसी विभेदन का प्रेरण
1) चरण 1 में प्राप्त माउस अस्थि मज्जा कोशिकाओं की गणना करें और कोशिका सांद्रता को 0.5-1× 10 तक समायोजित करें6/एमएल आरपीएमआई 1640 पूर्ण संवर्धन माध्यम के साथ जिसमें 10% एफबीएस हो।
2) 24 वेल कल्चर प्लेट में प्लेट करें, प्रति वेल 1 मिली कोशिकाएं, पुनः संयोजक माउस जीएम-सीएसएफ (20 .) डालें एनजी/एमएल) और आईएल-4 (10 एनजी/एमएल), और 37℃, 5% CO में संवर्धन2 इनक्यूबेटर। यह संस्कृति का 0 वां दिन है।
【टिप्पणी】
एक। सामान्यतः, लगभग 4-5x107 एक चूहे से अस्थि मज्जा कोशिकाओं को एकत्र किया जा सकता है, इसलिए 24-वेल प्लेट के कम से कम 40-50 वेल प्लेट किए जा सकते हैं।
बी। जीएम-सीएसएफ और आईएल-4 की सांद्रता सीमा 20-50 है एनजी/एमएल और 10-40 एनजी/एमएल, क्रमश।
3) प्रत्येक 2 दिन में कल्चर प्लेट को धीरे से हिलाएं, फिर 3/4 मात्रा को ताजा कल्चर माध्यम से प्रतिस्थापित करें और साइटोकाइन्स की पूर्ति करें।
4) 5वें और 8वें दिन के बीच, निलंबित कोशिकाओं और शिथिल रूप से जुड़ी कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए संवर्धन माध्यम को धीरे से उड़ाएं।
5) 1200 पर अपकेंद्रित्र आरपीएम के लिए 5 मिनट और सतह पर तैरने वाले पदार्थ को त्याग दें।
6) कोशिकाओं को 10% FBS युक्त RPMI 1640 पूर्ण संवर्धन माध्यम में पुनः निलंबित करें और उनकी गिनती करें, फिर कोशिका सांद्रता को 1×10 पर समायोजित करें6/एमएल, और पुनः संयोजक माउस जीएम-सीएसएफ (20 .) जोड़ें एनजी/एमएल) और आईएल-4 (10 एनजी/एमएल).
7 ) कोशिकाओं को 100 मिमी कल्चर डिश (प्रति डिश 10 मिलीलीटर तक) या 6-वेल कल्चर प्लेट (2 मीटर/वेल) में रखें।
8) 37℃, 5% CO में संवर्धन जारी रखें2 1-2 दिनों के लिए इनक्यूबेटर में रखें।
9) निलंबित कोशिकाओं को एकत्रित करें, जो अधिक परिपक्व BMDCs हैं।
【टिप्पणी】
एक। चरण 2.5-2.8 पुनः-प्लेटिंग चरण हैं, जिनका उद्देश्य चरण 2.4 में प्राप्त BMDC को अधिक परिपक्व बनाना है।
बी। पुनः प्लेटिंग के 3 घंटे के भीतर, कई काँटेदार आसंजक कोशिकाओं को डीसी समूहों से पलायन करते हुए देखा जा सकता है, और संवर्धन के 1 दिन बाद, ये आसंजक कोशिकाएँ संवर्धन प्लेट के तल से अलग हो जाती हैं, और कई विशिष्ट डीसी संवर्धन माध्यम में तैरते हुए देखे जा सकते हैं।
3.1.3 बीएमडीसी की पूर्ण परिपक्वता
[नोट] चरण 2 में प्राप्त BMDCs पूरी तरह से परिपक्व DC नहीं हैं। यदि आप पूरी तरह से परिपक्व DC प्राप्त करना चाहते हैं, तो आपको अभी भी LPS, CD40L या TNF-a द्वारा प्रेरित होना होगा।
1) चरण 2.4 या 2.9 में प्राप्त BMDC को 1200 पर सेंट्रीफ्यूज करें आरपीएम के लिए 5 मिनट और सतह पर तैरने वाले पदार्थ को त्याग दें।
2) पुनः संयोजक माउस जीएम-सीएसएफ (20 .) युक्त आरपीएमआई पूर्ण संवर्धन माध्यम के साथ अवक्षेप को पुनः निलंबित करें एनजी/एमएल) और आईएल-4 (10 एनजी/एमएल), और सेल सांद्रता को 1×10 पर समायोजित करें6गिनती के बाद /ml.
3) 24-वेल कल्चर प्लेटों में जोड़ें और परिपक्वता प्रेरक जैसे TNF-α (250) जोड़ें यू/एमएल), एलपीएस (1 μg/mL), या CD40L (1 μg/एमएल).
4) 37℃, 5% CO में संवर्धन2 2 दिनों के लिए इनक्यूबेटर में रखें।
5) निलंबित कोशिकाओं और दीवार से शिथिल रूप से जुड़ी हुई कोशिकाओं को इकट्ठा करें, जो परिपक्व वृक्षाकार कोशिकाएं हैं।
3.2【बीएमडीसी बड़े पैमाने पर उत्पादन विधि】-सोन विधि
【पृष्ठभूमि】
एक। इस विधि से 30-40×10 प्राप्त किया जा सकता है6 7 दिनों के भीतर डीसी/माउस, जो इनाबा क्लासिक विधि से 7-10 गुना अधिक है। डीसी को 14.5% मेट्रिज़ामाइड ग्रेडिएंट के माध्यम से सेंट्रीफ्यूज करने के बाद, शुद्धता (यानी CD11c+/I-Ab+ कोशिकाएं) 85-95% तक पहुँच सकती है।
बी। इस विधि द्वारा प्राप्त डीसी की एंडोसाइटोसिस क्षमता इनाबा क्लासिक विधि की तुलना में कमजोर है, लेकिन स्रावित आईएल-12पी70 की मात्रा समान है।
सी। इस विधि द्वारा प्राप्त डीसी में इनाबा क्लासिक विधि की तुलना में मिश्रित लिम्फोसाइट प्रतिक्रिया में अधिक मजबूत उत्तेजना क्षमता होती है।
डी। इस विधि द्वारा प्राप्त डीसी मजबूत विशिष्ट टी कोशिका प्रतिक्रिया को प्रेरित कर सकता है।
इ. संक्षेप में, सोन विधि क्लासिक विधि की तुलना में अधिक से अधिक परिपक्व BMDC प्राप्त कर सकती है।
【खेती के चरण】
3.2.1 चूहे की अस्थि मज्जा कोशिकाएं प्राप्त करना
इनाबा विधि (संशोधित) में संबंधित चरण देखें।
3.2.2 बड़ी मात्रा में बीएमडीसी तैयार करना
1) चरण 1 में प्राप्त माउस अस्थि मज्जा कोशिकाओं की गणना करें और कोशिका सांद्रता को 2×10 पर समायोजित करें5/एमएल आरपीएमआई 1640 पूर्ण संवर्धन माध्यम जिसमें 10% एफबीएस शामिल है.
2) 6-वेल कल्चर प्लेटों में फैलाएं, प्रति वेल 5ml कोशिकाएं, पुनः संयोजक माउस GM-CSF (1000) जोड़ें यू/एमएल) और आईएल-4 (1000 यू/एमएल), और 37℃, 5% CO में संवर्धन2 अण्डे सेने की मशीन.
3) संवर्धन के चौथे दिन, संवर्धन प्रणाली को पुनः संयोजक माउस जीएम-सीएसएफ (1000) के साथ पूरक करें यू/एमएल) और आईएल-4 (1000 यू/एमएल).
4) संस्कृति के 7वें दिन डीसी एकत्र करें, 2-4 के साथ पुनः निलंबित करें एमएल आरपीएमआई 1640 पूर्ण संवर्धन माध्यम, 14.5% (w/v) मेपेनेमा की बराबर मात्रा में जोड़ें, और 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर अपकेंद्रित्र करें न्यूनतम 1200xg.
5) मध्य परत को इकट्ठा करें और बाद में उपयोग के लिए इसे RPMI 1640 पूर्ण संवर्धन माध्यम से तीन बार धो लें।
[टिप्पणी] इस समय DC एक अपरिपक्व BMDC है। यदि आप इसे और परिपक्व बनाना चाहते हैं, तो कृपया चरण 3 पर जाएँ।
3.2.3 बीएमडीसी की पूर्ण परिपक्वता
1) चरण 2.4 में एकत्रित BMDCs को पुनः प्लेट किया गया, तथा पुनः संयोजक माउस GM-CSF (1000) मिलाया गया यू/एमएल) और आईएल-4 (1000 यू/एमएल), साथ ही एलपीएस (1-10 μg/एमएल) संस्कृति प्रणाली के लिए
2) 37℃, 5% CO में संवर्धित2 परिपक्व बीएमडीसी प्राप्त करने के लिए उन्हें 2 दिनों के लिए इनक्यूबेटर में रखा जाता है।
3.3【बीएमडीसी द्रव्यमान तैयारी विधि】-लुट्ज़ विधि
【पृष्ठभूमि】
एक। लुट्ज़ विधि, सोन विधि के समान है, और दोनों विधियों से बड़ी मात्रा में BMDC तैयार किया जा सकता है, लेकिन लुट्ज़ विधि, सोन विधि की तुलना में अधिक व्यापक रूप से उपयोग की जाती है।
बी। इस विधि से 1-3 x 10 तक अधिक BMDC प्राप्त किया जा सकता है8 डीसी/माउस, और शुद्धता 90-95% तक पहुँच सकती है;
सी। इस विधि में प्रयुक्त साइटोकाइन सांद्रता सोन विधि की तुलना में बहुत कम है, केवल 200 यू/एमएल, और यह 30-100 तक गिर जाता है यू/एमएल संस्कृति के 8 वें से 10 वें दिन तक, जो अभिकर्मक लागत को बहुत बचा सकता है;
डी। इस विधि और इनाबा क्लासिक विधि और सोन विधि के बीच सबसे बड़ा अंतर यह है कि अस्थि मज्जा कोशिकाओं को सेल कल्चर प्लेट के बजाय बैक्टीरियल कल्चर डिश (पेट्री डिश) में संवर्धित किया जाता है। इनाबा ने बताया कि बैक्टीरियल कल्चर डिश अस्थि मज्जा में मैक्रोफेज के लिए दीवार से चिपकना आसान नहीं है, जिससे मैक्रोफेज के विकास को बाधित किया जा सकता है और डीसी परिपक्वता पर मैक्रोफेज के निरोधात्मक प्रभाव से बचा जा सकता है। यह मुख्य कारण हो सकता है कि इस विधि से कम प्लेटिंग घनत्व पर बड़ी संख्या में BMDC प्राप्त किया जा सकता है।
इ. हालांकि, इस विधि का कल्चर समय अपेक्षाकृत लंबा है, जिसके लिए 10-12 दिन की आवश्यकता होती है। एक ओर, यह अधिक BMDCs प्राप्त करने के लिए है। दूसरी ओर, अधिकांश ग्रैनुलोसाइट्स और लिम्फोसाइट्स इतने लंबे समय तक जीवित रहना मुश्किल है, इसलिए अंततः प्राप्त BMDCs की शुद्धता में सुधार किया जा सकता है;
एफ। यह विधि केवल प्रेरण संस्कृति के लिए जीएम-सीएसएफ का उपयोग करती है, और प्राप्त बीएमडीसी में अपरिपक्व और परिपक्व डीसी दोनों होते हैं। परिपक्वता को और बेहतर बनाने के लिए, प्रेरण के 1-2 दिनों के लिए एलपीएस या टीएनएफ-α का उपयोग करने की आवश्यकता है, और परिपक्व डीसी कोशिकाओं की सामग्री 50-70% तक पहुंच जाएगी।
【खेती के चरण】
3.3.1 चूहे की अस्थि मज्जा कोशिकाएं प्राप्त करना
इनाबा विधि (संशोधित) में संबंधित चरणों को देखें, और ध्यान दें कि हेमोलिसिस चरण को छोड़ दिया जाना चाहिए।
3.3.2 बीएमडीसी की बड़े पैमाने पर तैयारी
1) चरण 1 में प्राप्त माउस अस्थि मज्जा कोशिकाओं की गणना करें और कोशिका सांद्रता को 2×10 पर समायोजित करें5/एमएल आरपीएमआई 1640 पूर्ण संवर्धन माध्यम के साथ जिसमें 10% एफबीएस हो;
2) 100 मिमी बैक्टीरिया कल्चर डिश (पेट्री डिश) में फैलाएं, प्रति डिश 10 मिलीलीटर कोशिकाएं, और पुनः संयोजक माउस जीएम-सीएसएफ (200) जोड़ें यू/एमएल), और 37℃, 5% CO2 इनक्यूबेटर पर संवर्धन;
[टिप्पणी] यहां पर जीवाणु संवर्धन डिश का उपयोग किया जाता है, कोशिका संवर्धन प्लेट का नहीं।
3) तीसरे दिन, 20 मिलीग्राम युक्त पूर्ण संवर्धन माध्यम की 10 मिलीलीटर मात्रा डालें एनजी/एमएल पुनः संयोजक माउस जीएम-सीएसएफ को संस्कृति डिश में डालें;
4) 6वें और 8वें दिन माध्यम का आधा हिस्सा बदल दें, यानी पुराने संवर्धन माध्यम को इकट्ठा कर लें, 20 वाले पूर्ण संवर्धन माध्यम के साथ सेल गोली को पुनः निलंबित कर दें एनजी/एमएल सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद पुनः संयोजक माउस जीएम-सीएसएफ, और फिर सेल निलंबन को मूल डिश में वापस डाल दिया;
5) 10वें दिन कोशिकाओं को एकत्र किया जा सकता है, जो कि BMDCs हैं।
3.3.3 बीएमडीसी की पूर्ण परिपक्वता
1) संस्कृति के 10वें दिन डीसी को पिपेट के साथ धीरे से उड़ाकर निलंबित कोशिकाओं को इकट्ठा करें, और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 300xg पर सेंट्रीफ्यूज करें;
2) सतह पर तैरनेवाला पदार्थ त्यागें, सेल गोली को 10 मिलीलीटर आरपीएमआई 1640 पूर्ण संवर्धन माध्यम के साथ पुनः निलंबित करें, और फिर इसे 100 मिमी सेल संवर्धन प्लेट पर फैलाएं;
3) पुनः संयोजक माउस GM-CSF (100 .) जोड़ें यू/एमएल) और टीएनएफ-α (500 यू/एमएल), या पुनः संयोजक माउस जीएम-सीएसएफ (100 यू/एमएल) और एलपीएस (1 μg/एमएल);
4) 37℃, 5% CO में संवर्धन जारी रखें2 1-2 दिनों के लिए इनक्यूबेटर में रखें।
4. बीएमडीसी की पहचान
एल रूपात्मक अवलोकन: अधिकांश BMDCs कालोनियों में बढ़ते हैं, और कोशिकाओं में कई वृक्षाकार उभार होते हैं, जो परिपक्व BMDCs में अधिक स्पष्ट होते हैं।
एल सेल फेनोटाइप विश्लेषण: डीसी कोशिकाओं की सतह पर CD11c, CD40, CD80, CD86, MHC वर्ग II अणुओं (IA/IE) की अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग किया गया। BMDCs इन अणुओं को अत्यधिक व्यक्त करते हैं, और पूरी तरह से परिपक्व BMDCs में इन अणुओं की अभिव्यक्ति और भी बढ़ जाएगी।
एल मिश्रित लिम्फोसाइट प्रतिक्रिया (एमएलआर): बीएमडीसी में मजबूत उत्तेजक क्षमता होती है, और परिपक्वता जितनी अधिक होती है, उत्तेजक क्षमता उतनी ही मजबूत होती है।
5. परिपक्वता प्रेरक का चयन कैसे करें?
LPS, CD40L और TNF-α मानव DC और माउस DC दोनों के लिए आम तौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले और प्रभावी परिपक्वता प्रेरक हैं। TNF-a में तीनों में से DC परिपक्वता को प्रेरित करने की सबसे कमज़ोर क्षमता है। LPS और CD40L दोनों ही इन विट्रो में DC पूर्ण परिपक्वता के लिए मज़बूत प्रेरक हैं। दोनों द्वारा प्रेरित DC की परिपक्वता समान है, लेकिन प्रेरित साइटोकाइन स्पेक्ट्रम अलग है। CD40L-प्रेरित परिपक्व BMDC विवो में सबसे मज़बूत इम्यूनोरेगुलेटरी क्षमता दिखाता है, जिसमें सुरक्षात्मक और चिकित्सीय ट्यूमर प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की पीढ़ी शामिल है। LPS के साथ DC पूर्ण परिपक्वता को उत्तेजित करने के लिए इस्तेमाल की जाने वाली सांद्रता आम तौर पर 1-10 होती है μg/mL, लेकिन वास्तव में 0.1 μg/mL का बहुत मजबूत प्रभाव होता है, लेकिन बीमा उद्देश्यों के लिए, 1 μg/mL का उपयोग आम तौर पर किया जाता है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि CD40L अणु TNF लिगैंड परिवार से संबंधित हैं, जिसकी विशेषता यह है कि वे केवल ट्रिमर बनाने के बाद ही कार्य कर सकते हैं। इसलिए, डीसी को उत्तेजित करने के लिए पुनः संयोजक CD40L ट्रिमर प्रोटीन का उपयोग करना सबसे अच्छा है, जिसका अच्छा प्रभाव होगा। यदि DC को उत्तेजित करने के लिए CD40L मोनोमर्स का उपयोग किया जाता है, तो अधिकांश मामलों में परिपक्वता बहुत अधिक नहीं होती है।
6. प्रशिक्षण पद्धति का चयन
तालिका नंबर एक।बीएमडीसी तैयार करने के लिए तीन सामान्य प्रयोगात्मक विधियों की तुलना
| पैरामीटर | क्लासिक बीएमडीसी संस्कृति विधि - इनाबा विधि | बीएमडीसी की बड़े पैमाने पर तैयारी - सोन विधि | बीएमडीसी की बड़े पैमाने पर तैयारी - लुट्ज़ विधि |
| PubMed में उद्धरणों की संख्या | 783 | 24 | 663 |
| अस्थि मज्जा हेमोलिसिस, लाल रक्त कोशिकाओं का लिसिस | हाँ | हाँ | नहीं |
| अस्थि मज्जा सबसे पहले लिम्फोसाइटों को हटाता है | हाँ | नहीं | नहीं |
| संवर्धन के दौरान ग्रैन्यूलोसाइट्स को हटाना | हाँ | नहीं | नहीं |
| अस्थि मज्जा कोशिकाओं की प्रारंभिक प्लेटिंग मात्रा | 1 मिलीलीटर | 15मि.ली. | 10मि.ली. |
| अण्डे सेने की मशीन | 24-वेल सेल कल्चर प्लेट्स | 6-वेल सेल कल्चर प्लेट | 100 मिमी जीवाणु संवर्धन डिश |
| संस्कृति माध्यम | आरपीएमआई 1640+10% एफसीएस | ||
| माउस जीएम-सीएसएफ की सांद्रता | 200-1000 यू/एमएल | प्रारंभिक सांद्रता 125-1000 है यू/एमएल चौथे और सातवें दिन, पर्याप्त मात्रा में जी.एम.-सी.एस.एफ. और आई.एल.-4 को संवर्धन प्रणाली में मिलाया जाता है। | प्रारंभिक जोड़ी गई सांद्रता 200 है यू/एमएल.3-100 यू/एमएल 10वें दिन के बाद |
| माउस आईएल-4 | जरूरत नहीं | ज़रूरत，सांद्रता जीएम-सीएसएफ के समान है | जरूरत नहीं |
| द्रव विनिमय विधि | दूसरे और चौथे दिन, पुराने संवर्धन माध्यम (जिसमें कोशिकाएं होती हैं) का 50%-75% निकाल दें, तथा उसके स्थान पर पर्याप्त GM-CSF युक्त ताजा पूर्ण संवर्धन माध्यम डालें। | / | तीसरे दिन, जी.एम.-सी.एस.एफ. युक्त सम्पूर्ण संवर्धन माध्यम की समान मात्रा डाली गई। 6वें, 8वें और 10वें दिन, माध्यम का आधा भाग बदल दिया गया। पुराने संवर्धन माध्यम (जिसमें कोशिकाएँ थीं) को चूसा गया, अपकेंद्रित किया गया, जी.एम.-सी.एस.एफ. युक्त ताजा सम्पूर्ण संवर्धन माध्यम में पुनः निलंबित किया गया और फिर वापस डाल दिया गया। |
| पासेजिंग (विस्तार) से पहले संवर्धन समय | 6 दिन | 7 दिन | 10 दिन |
| पासेजिंग (परिपक्वता) के बाद संस्कृति का समय | 2 दिन | कोई नहीं | 1-2 दिन |
| पूर्ण परिपक्वता प्रेरक | टीएनएफ-ɑ（250 यू/एमएल） | एलपीएस(1-10 μg/एमएल) | टीएनएफ-ɑ（250 यू/एमएल）या एलपीएस(1 μg/एमएल) |
| डीसी सेल हार्वेस्ट का समय | 7-8 दिन | 7-8 दिन | 10-13 दिन |
| डीसी शुद्धता | दिन 8:60-70% | दिन 7:85-95% | दिन 10-12:80-90% |
| डीसी उत्पादन/माउस | (5-7)×106 | (3-4)×107 | (1-3)×108 |
7. अनुशंसित डीसी संस्कृति अभिकर्मक
| प्रोडक्ट का नाम | बिल्ली | आकार |
| 91108तों | 5 μg/50 μg/100 μg/500 माइक्रोग्राम | |
| 90144ईएस | 5 μg/50 μg/100 μg/500 माइक्रोग्राम | |
| 90621ईएस | 5 μg/20 μg/50 μg/500 माइक्रोग्राम | |
| 94016ईएस | 25 μg/100 μg/500 माइक्रोग्राम |