हालांकि, T4 DNA लाइगेज को व्यावहारिक अनुप्रयोगों में अभी भी कुछ चुनौतियों का सामना करना पड़ रहा है, जिसमें खराब स्थिरता, उच्च एडाप्टर-एडाप्टर लिगेशन या कम DNA लाइब्रेरी यील्ड शामिल है। इन मुद्दों के कारण प्रयोगात्मक दक्षता में कमी, डेटा की गुणवत्ता में कमी, प्रयोगात्मक परिणामों की खराब पुनरावृत्ति और कम उत्पाद शुद्धता हो सकती है, जिससे आणविक जीव विज्ञान प्रयोगों की समग्र प्रभावशीलता और अनुक्रमण डेटा की सटीकता प्रभावित हो सकती है। इन समस्याओं को दूर करने के लिए, येसेन ने अपनी सहायक कंपनी मोलफ्यूचर के अभिनव ज़ाइमएडिटर पर आधारित^™ एंजाइम इवोल्यूशन प्लेटफॉर्म ने टी4 डीएनए लाइगेज पर एंजाइम इवोल्यूशन का कार्य किया है।

चित्र 1 टी4 डीएनए लाइगेस की प्रतिक्रिया सिद्धांत का योजनाबद्ध आरेख^[1]

चित्र 2 टी4 डीएनए लाइगेस की संरचना

तर्कसंगत डिजाइन के अलावा, स्थिरता, गतिविधि और अवशिष्ट गतिविधि की जांच करके MTPS विधि के साथ T4 DNA लाइगेज का निर्देशित विकास किया गया। और 10 से अधिक की लाइब्रेरी⁴ म्यूटेंट की जांच की गई। उत्परिवर्तन डेटा के गहन विश्लेषण के बाद, शुद्धिकरण और कठोर परीक्षण के लिए आशाजनक उम्मीदवारों का चयन किया गया। फिर तर्कसंगत डिजाइन और निर्देशित विकास द्वारा प्राप्त सभी विजेताओं को परिष्कृत शुद्धिकरण के बाद विस्तृत लक्षण वर्णन से गुजरना पड़ा, जिसमें गतिविधि, स्थिरता, एडाप्टर सेल्फ-लिगेशन, डीएनए खंड सेल्फ-लिगेशन और डीएनए उपज का आकलन शामिल था। G1 म्यूटेंट के आधार पर, टीम ने डीएनए शफलिंग और संयुक्त निर्देशित उत्परिवर्तन डिजाइन का संचालन किया गया ताकि विभिन्न अनुप्रयोग आवश्यकताओं को पूरा करने वाले असाधारण उत्परिवर्ती प्राप्त किए जा सकें।

अनुक्रमण सत्यापन के कई दौर के साथ उत्परिवर्ती से बाजार उत्पाद तक

ज़ाइमएडिटर^टीएम एंजाइम इवोल्यूशन प्लेटफॉर्म ने एंजाइम इवोल्यूशन प्रौद्योगिकी के माध्यम से उच्च तापीय स्थिरता, उच्च लाइब्रेरी उपज और कम एडाप्टर सेल्फ-लिगेशन के साथ एक टी4 डीएनए लाइगेज उत्परिवर्ती को सफलतापूर्वक विकसित किया है। वर्तमान में उन्नत T4 DNA लाइगेज को सफलतापूर्वक लॉन्च किया गया है - Hieff® वर्सेटाइल T4 DNA लाइगेज (600 U/μL) (कैट#12996ES)। यह उत्पाद बंधन दक्षता और तापीय स्थिरता के मामले में पारंपरिक वाइल्ड-टाइप टी4 डीएनए लाइगेस से बेहतर प्रदर्शन करता है, और इसे उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण द्वारा सत्यापित किया गया है, जिससे उत्कृष्ट गुणवत्ता सुनिश्चित होती है।

डेटा की प्रस्तुति

1.उच्च तापीय स्थिरता

येसेन से प्राप्त टी4 डीएनए लाइगेस म्यूटेंट को 42 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मा उपचार के अधीन किया गया। 0, 2, और 4 घंटे के लिए, और विक्रेता क्यू, एन, ए, और टी से टी 4 डीएनए लाइगेस के साथ तुलना की गई।इसके बाद, टी4 डीएनए लाइगेज की तापीय स्थिरता की तुलना करने के लिए येसेन डीएनए लाइब्रेरी कंस्ट्रक्शन किट (कैट#12927ईएस) के साथ 1 µg खंडित गोजातीय जीडीएनए का उपयोग करके एक संपूर्ण जीनोम डीएनए लाइब्रेरी का निर्माण किया गया।

चित्र 3 42℃ पर थर्मल स्थिरता परीक्षण

परिणाम:

थर्मल स्थिरता: येसेन ≈ विक्रेता एन ≈ विक्रेता ए > विक्रेता टी > विक्रेता क्यू।

2. उच्च लाइब्रेरी यील्ड

यीसेन के टी4 डीएनए लाइगेस उत्परिवर्ती का परीक्षण उच्च और निम्न डीएनए इनपुट स्तरों पर लाइब्रेरी यील्ड के लिए किया गया, जिसकी तुलना विक्रेता क्यू, एन, ए और टी के टी4 डीएनए लाइगेस से की गई। यीसेन डीएनए लाइब्रेरी निर्माण किट (कैट#12927ईएस) का उपयोग किया गया, जिसमें डीएनए लाइब्रेरी बनाने के लिए 1 µg और 0.5 ng खंडित गोजातीय जीडीएनए इनपुट किया गया।

चित्र 4 डीएनए लाइब्रेरी यील्ड विश्लेषण

परिणाम:

लाइब्रेरी यील्ड (1 µg gDNA): येसेन > विक्रेता Q ≈ विक्रेता T ≈ विक्रेता A > विक्रेता N. लाइब्रेरी यील्ड (0.5 µg gDNA): येसेन ≈ विक्रेता Q ≈ विक्रेता A ≈ विक्रेता T > विक्रेता N.

3.लोअर एडाप्टर सेल्फ-लिगेशन

येसेन के टी4 डीएनए लिगेज म्यूटेंट की तुलना वेंडर क्यू, एन, ए और टी के टी4 डीएनए लिगेज से एडेप्टर सेल्फ-लिगेशन के लिए की गई। येसेन डीएनए लाइब्रेरी कंस्ट्रक्शन किट (कैट#12927ES) का इस्तेमाल किया गया, जिसमें 0 एनजी और 0.5 एनजी खंडित बोवाइन जीडीएनए को पूरे जीनोम डीएनए लाइब्रेरी बनाने के लिए इनपुट किया गया।

चित्र 5 0 एनजी (बाएं) और 0.5 एनजी (दाएं) जीडीएनए इनपुट के साथ एडेप्टर सेल्फ-लिगेशन डेटा

परिणाम:

1) एडाप्टर सेल्फ-लिगेशन दर (0 एनजी जीडीएनए): विक्रेता एन > येसेन > विक्रेता टी > विक्रेता ए > विक्रेता क्यू।

2) एडाप्टर सेल्फ-लिगेशन दर (0.5 एनजी जीडीएनए): यीसेन > विक्रेता टी > विक्रेता क्यू ≈ विक्रेता एन > विक्रेता ए।

हमसे संपर्क करें

येसेन ने पारंपरिक T4 DNA लिगेज की सीमाओं को सफलतापूर्वक पार कर लिया है, एक T4 DNA लिगेज उत्पाद पेश किया है जो थर्मल स्थिरता, लाइब्रेरी यील्ड और एडेप्टर सेल्फ-लिगेशन में उत्कृष्ट है। इस प्रक्रिया में, कंपनी ने म्यूटेंट की एक समृद्ध लाइब्रेरी जमा की है, जो शोधकर्ताओं को विभिन्न प्रयोगात्मक आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए कई विकल्प प्रदान करती है। यदि आप हमारे उत्पादों या T4 DNA लिगेज म्यूटेंट में रुचि रखते हैं, तो कृपया निम्नलिखित तरीकों से हमसे संपर्क करने में संकोच न करें।

ईमेल: order1@yeasen.com (हम)

फ़ोन: +1 240-472-6069 (यूएस)

इसके अतिरिक्त, येसेन T4 DNA लाइगेज उत्पाद श्रृंखला की एक श्रृंखला प्रदान करता है। उत्पाद जानकारी के बारे में पूछताछ करने के लिए उत्पाद लिंक पर क्लिक करें

संदर्भ

[1] शुमन एस.डी.एन.ए. लिगेज: प्रगति और संभावनाएं[जे]जर्नल ऑफ बायोलॉजिकल केमिस्ट्री, 2009, 284(26):17365-17369.