RNase HII, जिसे RNase H2 के नाम से भी जाना जाता है, एक एंडोरिबोन्यूक्लिऐस है जो विशेष रूप से एक डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए हेलिक्स के भीतर स्थित एकल राइबोन्यूक्लियोटाइड के 5' छोर पर फॉस्फोडाइस्टर बॉन्ड को लक्षित करता है और उसे अलग करता है, जिससे 5' फॉस्फेट और 3' हाइड्रॉक्सिल समूह प्राप्त होता है (चित्र 1)। यह एंजाइम सिंगल-स्ट्रैंडेड आरएनए के प्रति न्यूनतम दरार गतिविधि प्रदर्शित करता है और डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए (dsDNA) और सिंगल-स्ट्रैंडेड डीएनए (ssDNA) दोनों के खिलाफ निष्क्रिय है। 50°C से 75°C के तापमान रेंज के भीतर कार्यात्मक रूप से सक्रिय, RNase HII 70°C और 75°C के बीच के तापमान पर चरम प्रदर्शन तक पहुँचता है। डीएनए साइटों पर लक्षित, एकल-साइट दरार करने की अपनी अनूठी क्षमता का लाभ उठाते हुए, जहां राइबोन्यूक्लियोटाइड एकीकृत होता है, डीएसडीएनए या एसएसडीएनए को प्रभावित किए बिना, आरएनएएस एचआईआई प्रतिक्रिया आरंभ के लिए एक सटीक "ट्रिगर" के रूप में कार्य करता है, जिसमें प्राइमर सक्रियण और विस्तार शामिल है, ताकि विशिष्ट प्रवर्धन प्राप्त किया जा सके। यह एंजाइम आरएनएएस एच-निर्भर पीसीआर (आरएचपीसीआर), लूप-मध्यस्थ आइसोथर्मल प्रवर्धन (एलएएमपी) तकनीक और ओकाजाकी टुकड़ों में आरएनए घटकों के क्षरण में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है।
चित्र 1. RNase HII प्रतिक्रिया सिद्धांत का योजनाबद्ध आरेख
RNase HII के कार्यात्मक अनुप्रयोग
一. आरएनएएस एच-आश्रित पीसीआर(आरएचपीसीआर)
rhPCR RNase HII और विशेष रूप से डिज़ाइन किए गए, बंद क्लीवेबल rhPCR प्राइमर को PCR प्रक्रिया में शामिल करता है। यह दृष्टिकोण DNA-RNA हाइब्रिड के भीतर RNA को चुनिंदा रूप से हाइड्रोलाइज़ करने के लिए RNase HII की अनूठी संपत्ति का लाभ उठाता है, जबकि सिंगल-स्ट्रैंडेड या डबल-स्ट्रैंडेड DNA और RNA में फॉस्फोडाइस्टर बॉन्ड को बरकरार रखता है। नतीजतन, RNase HII केवल DNA-RNA हाइब्रिड को पचाता है और प्राइमर एक्सटेंशन की अनुमति देता है जब प्राइमर लक्ष्य DNA अनुक्रम के लिए पूरी तरह से पूरक होता है। यह लक्षित क्रिया प्रतिक्रिया की सटीकता को महत्वपूर्ण रूप से बढ़ाती है। RNase HII एकमात्र एंजाइम है जो राइबोन्यूक्लिक एसिड के 5' छोर पर क्लीविंग करके उत्परिवर्तन को प्रेरित किए बिना राइबोन्यूक्लियोटाइड्स को सटीक रूप से हटाने में सक्षम है। इसकी उच्च विशिष्टता, संवेदनशीलता और पुनरुत्पादकता के कारण, rhPCR एकल न्यूक्लियोटाइड बहुरूपता (SNP) का पता लगाने, जीन टाइपिंग, कई लक्ष्यों का एक साथ पता लगाने और पर्यावरणीय न्यूक्लिक एसिड विश्लेषण जैसे अनुप्रयोगों में विशिष्ट लाभ प्रदान करता है।
तकनीकी मार्ग
1. प्राइमर डिज़ाइन
प्राइमर डिज़ाइन को यह सुनिश्चित करना चाहिए कि काटने के बाद पिघलने का तापमान एनीलिंग तापमान से अधिक हो ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि प्राइमर पीसीआर चक्रों के दौरान टेम्पलेट से स्थिर रूप से जुड़ा रहे। rhPCR प्राइमर में तीन भाग होते हैं:
1）5' डीएनए खंड: मानक पीसीआर प्राइमरों की लंबाई और पिघलने के तापमान (टीएम) आवश्यकताओं के बराबर, यह आरएनएएस एचआईआई एंजाइम द्वारा काटे जाने के बाद टेम्पलेट डीएनए के साथ प्रभावी रूप से जोड़ा जा सकता है और विस्तारित हो सकता है।
2) एकल आरएनए बेस: आरएनएसे एचआईआई के लिए कटिंग साइट प्रदान करना।
3）3' डीएनए खंड: एक अवरोधक के साथ चार या पांच आधारों की लंबाई, आमतौर पर एक छोटा, गैर-विस्तार योग्य अणु जैसे प्रोपलीन ग्लाइकोल, जो अवरोधक को हटाए जाने तक डीएनए पोलीमरेज़ के विस्तार को रोकता है।
2.काटना और विस्तार
आरएचपीसीआर प्रतिक्रिया की शुरुआत में, प्राइमर और टेम्पलेट डीएनए मुक्त होते हैं। जब प्राइमर विशिष्ट आरएनए:डीएनए हेटेरोडुप्लेक्स टेम्पलेट से जुड़ता है, तो अवरुद्ध प्राइमर के आरएनए बेस 5'-साइड को आरएनएएस एचआईआई एंजाइम द्वारा पहचाना और काटा जाता है, जिससे 3'-हाइड्रॉक्सिल समूह वाला डीएनए ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड निकल जाता है, जो डीएनए पॉलीमरेज़ के विस्तार के लिए एक प्रारंभिक बिंदु प्रदान करता है। इसके बाद पारंपरिक पीसीआर प्रवर्धन प्रक्रिया होती है।
चित्र 2. rhPCR सिद्धांत का आरेख [1]
二.लूप-मध्यस्थ आइसोथर्मल प्रवर्धन (एलएएमपी)
लूप-मध्यस्थ आइसोथर्मल प्रवर्धन (एलएएमपी) जीन प्रवर्धन के लिए एक सरल और तेज़ विधि है जो थोड़े समय में आइसोथर्मल स्थितियों के तहत न्यूक्लिक एसिड को प्रवर्धित कर सकती है। हालांकि, कमरे के तापमान पर तैयारी के दौरान डीएनए पॉलीमरेज़ गतिविधि की शुरुआत के कारण, गैर-विशिष्ट बेमेल बनते हैं, जिससे थोड़ी मात्रा में मिसपेयरिंग और प्राइमर डिमर्स हो सकते हैं, जिससे मामूली संदूषण हो सकता है जिसके परिणामस्वरूप गलत सकारात्मक परिणाम हो सकते हैं।
RNase HII को LAMP प्रवर्धन प्रणाली में लागू करने से LAMP तकनीक में गलत सकारात्मकता की समस्या का प्रभावी ढंग से समाधान हो सकता है, जिससे नैदानिक निदान में इसके अनुप्रयोग का विस्तार हो सकता है। जैसा कि चित्र 3 में दिखाया गया है, RNase HII का उपयोग करते हुए प्राइमर-सक्रिय LAMP विधि (PA-LAMP), जब प्राइमर लक्ष्य ssDNA के साथ युग्मित होता है, तो RNase HII एंजाइम प्राइमर पर RNA को विशेष रूप से विभाजित करता है, इसे सक्रिय करता है और प्राइमर विस्तार की अनुमति देता है, विशिष्ट प्रवर्धन प्राप्त करता है और सिस्टम में गलत सकारात्मकता को प्रभावी ढंग से कम करता है।
चित्र 3. PA-LAMP सिद्धांत का योजनाबद्ध आरेख [2]
येसेन आरएनएसे HII
येसेन का RNase HII (कैट#14539) से व्युत्पन्न है पाइरोकोकस एबिस्सी, पेनसिल्वेनिया, और यह दूषित न्यूक्लिऐस, निकिंग एंजाइम और RNase अवशेषों से मुक्त है, कम होस्ट डीएनए संदूषण के साथ, सिस्टम में गलत सकारात्मकता को प्रभावी ढंग से कम करता है। YEASEN का RNase HII अत्यधिक गर्मी प्रतिरोधी है, जो 95 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के बाद भी अपनी गतिविधि बनाए रखता है, जिससे यह विभिन्न rhPCR प्रतिक्रिया प्रणालियों के साथ संगत है और LAMP और अन्य अनुप्रयोगों के लिए भी उपयुक्त है।
1. ई. कोली जीनोमिक डीएनए अवशेष < 0.5 प्रतियां/100 यू
का पता लगाना ई कोलाई RNase HII के विभिन्न बैचों में जीनोमिक डीएनए अवशेषों के अध्ययन से पता चला कि YEASEN के RNase HII के मेजबान जीनोमिक डीएनए अवशेष 0.5 प्रतियां/100 यू से बहुत कम हैं।
चित्र 4. का पता लगाना ई कोलाई जीनोमिक डीएनए अवशेष
2. 95°C ताप प्रतिरोध परीक्षण
RNase HII को 0 से 45 मिनट तक 95°C पर गर्म करने के बाद, RNase HII की एंजाइम गतिविधि का परीक्षण किया गया। परिणामों से पता चला कि 45 मिनट तक गर्म करने के बाद भी YEASEN के RNase HII में एंजाइम गतिविधि में लगभग कोई कमी नहीं आई।
चित्र 5. 95°C ताप प्रतिरोध परीक्षण
3. कोई एक्सोन्यूक्लिऐस, निकिंग एंजाइम या आरएनज़ अवशेष नहीं (1 यू खुराक)
आरएनसे एचआईआई के विभिन्न बैचों के 1 यू को उनके संबंधित सब्सट्रेट डीएनए/आरएनए के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे तक इनक्यूबेट करने पर, एगरोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस के परिणामों ने संकेत दिया कि आरएनसे एचआईआई में कोई एक्सोन्यूक्लिऐस, निकिंग एंजाइम या आरएनसे अवशेष नहीं था।
चित्र 6.एक्सोन्यूक्लिऐस, निकिंग एंजाइम और आरएनेज अवशेषों का पता लगाने के परिणाम
अनुशंसित संबंधित उत्पाद
| उत्पाद व्यवहार्यता | प्रोडक्ट का नाम | सूची की संख्या |
| आरएचपीसीआर、एलएएमपी | 14539ईएस 14541ईएस | |
| आरएचपीसीआर | 10101ईएस | |
| आरटी-लैंप | 14402ईएस | |
| 11111ईएस |
संदर्भ
[1] डोबोसी जेआर, रोज़ एसडी, बेल्ट्ज़ केआर, रूप एसएम, पॉवर्स केएम, बेहल्के एमए, वाल्डर जेए। आरएनएसे एच-निर्भर पीसीआर (आरएचपीसीआर): ब्लॉक किए गए क्लीवेबल प्राइमर का उपयोग करके बेहतर विशिष्टता और एकल न्यूक्लियोटाइड बहुरूपता का पता लगाना। बीएमसी बायोटेक्नोलोजी। 2011 अगस्त 10;11:80. doi: 10.1186/1472-6750-11-80।
[2] डु डब्ल्यूएफ, जीई जेएच, ली जेजे, एट अल. प्राइमर-एक्टिवेटेबल लूप-मेडिएटेड आइसोथर्मल एम्पलीफिकेशन (पीए-एलएएमपी) द्वारा एकल न्यूक्लियोटाइड उत्परिवर्तन का एकल-चरण, उच्च-विशिष्टता पता लगाना [जे]। एनालिटिका चिमिका एक्टा, 2019 (1050-): 1050. डीओआई: 10.1016 / j.aca.2018.10.068।