आप "ऑल-राउंडर" DNase I ? के बारे में कितना जानते हैं

डीऑक्सीराइबोन्यूक्लिऐस I (DNase I) एक गैर-विशिष्ट एंडोन्यूक्लिऐस है जो एकल-रज्जुक दोनों को पचाने में सक्षम है (एसएसडीएनए) और डबल स्ट्रैंडेड डीएनए (डीएसडीएनए)। यह फॉस्फोडाइस्टर बॉन्ड को हाइड्रोलाइज करता है, जिससे 5'-फॉस्फेट समूहों और 3'-ओएच समूहों के साथ मोनो-डिऑक्सीन्यूक्लियोटाइड और ओलिगो-डिऑक्सीन्यूक्लियोटाइड प्राप्त होते हैं। DNase I गतिविधि के लिए इष्टतम pH रेंज 7-8 है, और इसकी गतिविधि Ca पर निर्भर है2+ और इसे Mn जैसे द्विसंयोजी धातु आयनों द्वारा सक्रिय किया जा सकता है2+, एमजी2+, जेडएन2+, आदि। Mg की उपस्थिति में2+, DNase I किसी भी स्थान पर डबल-स्ट्रैंडेड DNA को बेतरतीब ढंग से विभाजित करता है। Mn की उपस्थिति में2+, डीएनएसे I एक ही स्थान पर दोहरे-रज्जुक वाले डीएनए को विभाजित कर सकता है, जिसके परिणामस्वरूप कुंद सिरे या 1-2 न्यूक्लियोटाइड ओवरहैंग के साथ संसक्त सिरे बनते हैं।

चित्र 1. Mg की उपस्थिति में DNase I द्वारा dsDNA को विभाजित करने का योजनाबद्ध आरेख2+ और एमएन2+

सामान्य DNase I मुख्य रूप से गोजातीय अग्न्याशय से शुद्ध किया जाता है या एक पुनः संयोजक एंजाइम है। गोजातीय अग्न्याशय से शुद्ध किए गए DNase I की तुलना में, पुनः संयोजक DNase I में अपेक्षाकृत कम अंतर्जात RNase स्तर होता है या इसे RNase-मुक्त उत्पादों के रूप में तैयार किया जा सकता है, जिससे यह RNase-संवेदनशील अनुप्रयोगों के लिए अधिक उपयुक्त हो जाता है, जैसे कि RNA नमूनों से DNA को हटाना।

अनुप्रयोग

अनुप्रयोगों के संबंध में, DNase I RNA अखंडता को बनाए रखने से संबंधित प्रयोगों में इसके उपयोग के लिए प्रसिद्ध है, जैसे कि DNA से मुक्त RNA निकालना, रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन से पहले gDNA के बिना RNA टेम्पलेट तैयार करना और इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन के बाद DNA टेम्पलेट को खराब करना। इसके अतिरिक्त, इसका उपयोग rRNA निष्कासन में DNA जांच को पचाने, निक ट्रांसलेशन के माध्यम से DNA लेबलिंग के लिए, फुटप्रिंटिंग विधि का उपयोग करके DNA-प्रोटीन इंटरैक्शन का विश्लेषण करने, यादृच्छिक DNA लाइब्रेरी बनाने, सेल लाइसेट्स या प्रोटीन अर्क की चिपचिपाहट को कम करने, सेल संस्कृति में एक योजक के रूप में सेल आसंजनों को पचाने और एपोप्टोसिस का पता लगाने के लिए TUNEL परख में सकारात्मक नियंत्रण के रूप में जीनोमिक DNA को आंशिक रूप से विभाजित करने के लिए किया जा सकता है। संक्षेप में, DNase I का उपयोग लगभग किसी भी अनुप्रयोग में किया जा सकता है जिसमें DNA के एंजाइमेटिक पाचन की आवश्यकता होती है। नीचे, कई सामान्य अनुप्रयोगों का संक्षिप्त परिचय दिया जाएगा।

  • आरएनए निष्कर्षण या रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन से पहले जीडीएनए को हटाना

प्रयोगशालाओं में आमतौर पर अध्ययन किए जाने वाले नमूने के रूप में आरएनए, अपनी गुणवत्ता के कारण प्रयोगात्मक डेटा की गुणवत्ता को बहुत प्रभावित करता है। आरएनए निष्कर्षण प्रक्रिया के दौरान जीडीएनए के अवशेषों से पूरी तरह से बचना आम तौर पर असंभव है। इसलिए, चुनौतीपूर्ण डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों (जैसे mRNA अभिव्यक्ति विश्लेषण, ट्रांसक्रिप्टोम विश्लेषण, आदि) का संचालन करने से पहले, आमतौर पर अवशिष्ट जीडीएनए को पचाने के लिए डीएनएस I के साथ आरएनए नमूनों का इलाज करने की सिफारिश की जाती है। जीडीएनए का पाचन आरएनए निष्कर्षण के दौरान, आरएनए निष्कर्षण के बाद या आरएनए रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन से पहले किया जा सकता है।

चित्र 2. DNase I-आधारित gDNA निष्कासन प्रक्रिया

  • इन विट्रो प्रतिलेखन में टेम्पलेट डीएनए को हटाना

इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन (IVT) मुख्य रूप से उपयुक्त सब्सट्रेट और बफर के प्रभाव में RNA का उत्पादन करने के लिए DNA को एक टेम्पलेट के रूप में उपयोग करता है। इस प्रक्रिया में आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले RNA पॉलीमरेज़ में T7, T3 और SP6 शामिल हैं, जो RNA संश्लेषण को उत्प्रेरित करने के लिए जिम्मेदार हैं। हालाँकि, संश्लेषित RNA उत्पाद में DNA अवशेष हो सकते हैं, और इन अवशेषों को हटाना डाउनस्ट्रीम प्रयोगों के लिए फायदेमंद है।

विशेष रूप से mRNA टीकों की विकास प्रक्रिया में, इन डीएनए अवशेषों को हटाना एक महत्वपूर्ण कदम है जो बाद की शुद्धिकरण प्रक्रियाओं की कठिनाई और अंतिम उत्पाद की शुद्धता को सीधे प्रभावित करता है।टेम्पलेट डीएनए को कुशलतापूर्वक समाप्त करने के लिए, डीएनएसे I का उपयोग आमतौर पर उपचार के लिए किया जाता है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि आरएनए नमूना डीएनए अवशेषों से मुक्त है, यह एक ऐसा कदम है जो प्रयोग की समग्र सटीकता और दक्षता में सुधार करने में मदद करता है।

चित्र 3: टेम्पलेट के रूप में रेखीयकृत प्लास्मिड का उपयोग करते हुए इन विट्रो प्रतिलेखन प्रक्रिया[4]

  • आरएनए लाइब्रेरी निर्माण और अनुक्रमण में आरआरएनए निष्कासन

जीवों में, rRNA अत्यधिक प्रचुर मात्रा में और अत्यधिक संरक्षित होता है, जो जैविक सूचना अनुसंधान प्राप्त करने के लिए बहुत कम महत्व रखता है। हालाँकि, प्रयोगों के दौरान निकाले गए कुल RNA का 95% मानव rRNA है, और इन rRNA की उपस्थिति लक्ष्य RNA का पता लगाने में बाधा उत्पन्न कर सकती है। इसलिए, RNA लाइब्रेरी की तैयारी और अनुक्रमण में, rRNA को आमतौर पर पहले हटा दिया जाता है। वर्तमान में, rRNA हटाने की मुख्य विधि RNAase पाचन है, और इसका मुख्य परिचालन चरण और सिद्धांत इस प्रकार हैं:

  1. कुल आरएनए निकालें;
  2. एकल-रज्जुक डीएनए जांच को आरआरएनए अणुओं के साथ संकरणित करें (नोट: आरआरएनए-विशिष्ट एकल-रज्जुक डीएनए जांच को डिजाइन और संश्लेषित करें);
  3. आरएनएएस एच संकरित आरआरएनए को ख़राब करता है;
  4. डीएनएसे I डीएनए जांच को ख़राब करता है;
  5. rRNA को सफलतापूर्वक हटा दिया जाता है, तथा गैर-rRNA RNA टेम्पलेट्स को पीछे छोड़ दिया जाता है।

चित्र 4: एंजाइमेटिक विधि पर आधारित rRNA निष्कासन सिद्धांत का योजनाबद्ध आरेख[5]

  • डीएनए लेबलिंग के लिए निक अनुवाद

प्रयोगशाला में डीऑक्सीराइबोन्यूक्लिक एसिड जांच को लेबल करने के लिए निक ट्रांसलेशन सबसे अधिक इस्तेमाल की जाने वाली विधि है। यह विधि DNase I और की संयुक्त क्रिया के माध्यम से प्राप्त की जाती है ई कोलाई डीएनए पोलीमरेज़ I.

मुख्य सिद्धांत इस प्रकार है:

  1. सबसे पहले, लेबल किए जाने वाले दोहरे-रज्जुक वाले डीएनए के प्रत्येक रज्जुक में कई एकल-रज्जुक निक्स बनाने के लिए डीएनएसे I की उचित सांद्रता का उपयोग करें, जिससे निक्स स्थलों पर 3' हाइड्रॉक्सिल टर्मिनी का निर्माण हो।
  2. फिर, 5'→3' एक्सोन्यूक्लिऐस गतिविधि का उपयोग करें कोलाईडीएनए पोलीमरेज़ I निक के 5' छोर से न्यूक्लियोटाइड को हटाने के लिए, जबकि 5'→3' पोलीमरेज़ की गतिविधि इ. कोलाई डीएनए पॉलीमरेज़ I निक के 3' छोर पर एक लेबलयुक्त न्यूक्लियोटाइड डालता है ताकि इसे ठीक किया जा सके। जैसे-जैसे निक डीएनए स्ट्रैंड के साथ आगे बढ़ता है, लेबलयुक्त न्यूक्लियोटाइड नए संश्लेषित डीएनए स्ट्रैंड में शामिल हो जाते हैं।

चित्र 5: निक ट्रांसलेशन द्वारा डीएनए लेबलिंग के सिद्धांत का योजनाबद्ध आरेख[6]

  • डीएनएसे I फुटप्रिंटिंग परख प्रयोग

डीएनएस I फुटप्रिंटिंग परख डीएनए अणुओं पर डीएनए-बाइंडिंग प्रोटीन के बंधन स्थलों की पहचान करने के लिए एक सटीक विधि है। सिद्धांत यह है कि डीएनए खंड से बंधे प्रोटीन डीएनएस I द्वारा क्षीण होने से बंधे हुए क्षेत्र की रक्षा करते हैं। एंजाइमेटिक पाचन के बाद, शेष खंड ("फुटप्रिंट") का उपयोग इसके अनुक्रम को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। जेल छवि में, उन क्षेत्रों के अनुरूप कोई बैंड नहीं हैं जहाँ प्रोटीन बंधा हुआ है।

मुख्य सिद्धांत इस प्रकार है:

  1. परीक्षण किए जाने वाले द्वि-रज्जुकी डीएनए अणु के एकल-रज्जुकी सिरों को लेबल करें।
  2. प्रोटीन को डीएनए के साथ मिलाएं और एंजाइमेटिक पाचन के लिए डीएनएसे I की उचित मात्रा मिलाएं, जिससे अलग-अलग लंबाई के डीएनए टुकड़े बनेंगे।एंजाइम की मात्रा को नियंत्रित किया जाना चाहिए ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि निकटवर्ती डीएनए खंडों में केवल एक न्यूक्लियोटाइड का अंतर हो, तथा बिना प्रोटीन वाले नियंत्रण को समानांतर रूप से शामिल किया जाना चाहिए।
  3. डीएनए से प्रोटीन निकालें, विकृत डीएनए को PAGE वैद्युतकणसंचलन द्वारा अलग करें, तथा नियंत्रण समूह के साथ तुलना करके पदचिह्न क्षेत्र के न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम की व्याख्या करने के लिए ऑटोरेडियोग्राफ़ करें।

चित्र 6: डीएनएसे I फुटप्रिंटिंग परख के सिद्धांत का योजनाबद्ध आरेख[7]

डीएनएस I येसेन का चयन गाइड

विभिन्न अनुप्रयोग आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए, येसेन प्रदान करता है पुनः संयोजक डीएनएस I में ई कोलाई, और इन विट्रो प्रतिलेखन और अन्य अनुप्रयोगों में mRNA की आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए GMP-ग्रेड DNase I प्रदान कर सकता है।

उत्पाद की स्थिति

आवेदन

प्रोडक्ट का नाम

सूची की संख्या

आरएनज़ मुक्त

आरएनए और प्रोटीन तैयारियों से डीएनए को हटाना

पुनः संयोजक DNase I (RNase-मुक्त)

10325ईएस

जीएमपी ग्रेड, आरएनज़ मुक्त

mRNA का इन विट्रो प्रतिलेखन

UCF.ME® डीऑक्सीराइबोन्यूक्लिऐस I (DNase I) GMP-ग्रेड

10611ईएस

संदर्भ

[1] एनडियाये सी, मेना एम, एलेमनी एल, एट अल. सिर और गर्दन के कैंसर में एचपीवी डीएनए, ई6/ई7 एमआरएनए, और पी16आईएनके4ए का पता लगाना: एक व्यवस्थित समीक्षा और मेटा-विश्लेषण [जे]। द लैंसेट ऑन्कोलॉजी, 2014, 15(12): 1319-1331।

[2] ब्रोकोलो एफ, फ्यूसेटी एल, रोसिनी एस, एट अल. गर्भाशय ग्रीवा के नमूनों में ऑन्कोजेनिक एचपीवी प्रकार-विशिष्ट वायरल डीएनए लोड और ई6/ई7 एमआरएनए डिटेक्शन की तुलना: एक मल्टीसेंटर अध्ययन के परिणाम [जे]। जर्नल ऑफ मेडिकल वायरोलॉजी, 2013, 85(3): 472-482।

[3] हुआंग जेड, फासको एमजे, कामिंस्की एल एस. मात्रात्मक आरएनए-पीसीआर में उपयोग के लिए आरएनए से दूषित डीएनए को हटाने के लिए डीएनएसे I का अनुकूलन [जे]। बायोटेक्निक्स, 1996, 20(6): 1012-1020।

[4] कांग डीडी, ली एच, डोंग वाई. क्लीनिक में अनुवाद को सक्षम करने के लिए इन विट्रो ट्रांसक्राइब्ड mRNA (IVT mRNA) की उन्नति [जे]। एडवांस्ड ड्रग डिलीवरी रिव्यू, 2023, 199: 114961।

[5] वाइमे आई, रेमी एस, स्वेनन आर, एट अल. आरएनए गिरावट के बिना डीएनएस I की अपरिवर्तनीय गर्मी निष्क्रियता [जे]। बायोटेक्निक्स, 2000, 29 (2): 252-256।

[6] एडोल्फ एस, हैमिस्टर एच. बायोटिन-लेबल डी-यूटीपी के साथ मेटाफ़ेज़ गुणसूत्रों का इन सीटू निक ट्रांसलेशन [जे]। मानव आनुवंशिकी, 1985, 69: 117-121।

[7] सॉन्ग सी, झांग एस, हुआंग एच. माइक्रोबियल जीनोम में प्रतिकृति उत्पत्ति की पहचान के लिए एक उपयुक्त विधि का चयन करना। फ्रंट माइक्रोबायोल, 2015, 6: 1049.

जाँच करना