तेजी से pngase f, केवल 10 मिनट में deglycosylation पूरा करना

ग्लाइकोप्रोटिओमिक्स और एंटीबॉडी दवा अनुसंधान के तेजी से विकास के साथ, ग्लाइकोसिलेशन संशोधन ने भी बहुत ध्यान आकर्षित किया है। कोशिकाओं और कोशिकाओं के बीच, और कोशिकाओं और रोगजनकों के बीच संपर्क मुख्य रूप से शर्करा और प्रोटीन की बातचीत के माध्यम से पूरा होता है, और ग्लाइकोसिलेशन ग्लाइकोकॉन्जुगेट्स के आसंजन गुणों को निर्धारित करता है। IgG में, Fc क्षेत्र में Asn297 पर संरक्षित N-लिंक्ड ग्लाइकोसिलेशन भी इसकी गतिविधि के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, कुछ एंटीबॉडी में अतिरिक्त N-ग्लाइकन भी होते हैं, जो Fc क्षेत्र में Asn297 पर संरक्षित साइट के साथ मिलकर एंटीबॉडी की पहचान, अर्ध-जीवन और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को प्रभावित करते हैं।

प्रोटीन ग्लाइकोसिलेशन एक जटिल पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन है जिसमें प्रोटीन पर विशिष्ट साइटों पर ग्लाइकेन चेन का कनेक्शन शामिल है। ग्लाइकेन चेन के प्रकार के आधार पर, ग्लाइकोप्रोटीन को एन-लिंक्ड ग्लाइकोप्रोटीन, ओ-लिंक्ड ग्लाइकोप्रोटीन आदि में विभाजित किया जाता है; इसके अलावा, प्रोटीन ग्लाइकोसिलेशन भी मेजबान सेल प्रकार और किण्वन स्थितियों (जैसे संस्कृति माध्यम, पीएच मान, तापमान, आदि) से प्रभावित होता है। इसलिए, ग्लाइकोप्रोटीन में आमतौर पर ग्लाइकोसिलेशन पैटर्न में विविधता होती है, जिसमें ग्लाइकोसिलेशन साइट्स, ग्लाइकोसिलेशन स्तर और ग्लाइकेन चेन की विशिष्ट संरचना शामिल होती है, जिससे ग्लाइकेन चेन विश्लेषण और संरचनात्मक लक्षण वर्णन कार्य बेहद चुनौतीपूर्ण हो जाता है। ग्लाइकेन चेन संरचनात्मक जानकारी की अधिकतम मात्रा प्राप्त करने के लिए, ग्लाइकेन चेन विश्लेषण की मुख्य रणनीति पहले प्रोटीन से ग्लाइकेन चेन को मुक्त करना और फिर विस्तृत विश्लेषण और लक्षण वर्णन करना है। इस रणनीति में, एक कुशल, सटीक और स्थिर डीग्लाइकोसिलेशन विधि महत्वपूर्ण है।

वर्तमान में डिग्लाइकोसिलेशन के लिए एंजाइमेटिक विधियों का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है।

ग्लाइकोप्रोटीन को उनके ग्लाइकेन चेन के प्रकार के आधार पर N-लिंक्ड और O-लिंक्ड ग्लाइकोपेप्टाइड में वर्गीकृत किया जा सकता है। N-लिंक्ड ग्लाइकोपेप्टाइड के लिए, आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले एंजाइम में पेप्टाइड N-ग्लाइकोसिडेस F (PNGase F), एंडोग्लाइकोसिडेस H (Endo H) और एंडोग्लाइकोसिडेस S (Endo S) शामिल हैं। PNGase F GlcNAc-Asn बॉन्ड को हाइड्रोलाइज करता है और उच्च मैनोज़, जटिल और हाइब्रिड ग्लाइकेन चेन को हटा सकता है। एंडो एच एन-ग्लाइकन चेन पेंटासैकेराइड कोर के भीतर ग्लाइकोसिडिक बॉन्ड को तोड़ता है। एंडो एस विशेष रूप से देशी IgG की भारी श्रृंखला के चिटोबायोस कोर से N-लिंक्ड ग्लाइकेन को तोड़ता है।

चित्र 1. पीएनजीएएस एफ, एंडो एच और एंडो एस का कटिंग स्थल।

उनमें से, पीएनजीएएसई एफ लगभग सभी एन-लिंक्ड को हटाने के लिए सबसे प्रभावी एंजाइमेटिक विधि है ग्लाइकोप्रोटीन में ऑलिगोसेकेराइड, जो एस्परैगिन द्वारा जुड़े उच्च-मैनोज़, हाइब्रिड और जटिल ऑलिगोसेकेराइड ग्लाइकोप्रोटीन को अलग कर सकते हैं, विशेष रूप से एन-लिंक्ड ग्लाइकेन को हटाते हैं। दरार स्थल है: सबसे भीतरी एन-एसिटाइलग्लुकोसामिन (GlcNAc) और एस्परैगिन अवशेष के बीच एमाइड बॉन्ड, जबकि एंजाइमेटिक हाइड्रोलिसिस के बाद प्रोटीन पर एस्परैगिन को एस्पार्टिक एसिड में परिवर्तित करना।

जब α1-6 फ्यूकोस GlcNAc कोर में स्थित होता है, तो PNGase F भी काट सकता है; केवल जब α1-3 फ्यूकोस GlcNAc कोर में स्थित होता है (पौधे और कीट ग्लाइकोप्रोटीन में सामान्य), तो PNGase F नहीं काट सकता।

हालांकि, पारंपरिक PNGase F एंजाइमेटिक प्रतिक्रिया में एंटीबॉडी N-ग्लाइकन को रिलीज़ करने के लिए कई घंटों की आवश्यकता होती है, और ग्लाइकन रिलीज़ के लिए प्राथमिकता के कारण, अपूर्ण डीग्लाइकोसिलेशन पक्षपाती परिणामों को जन्म दे सकता है, और प्राप्त ग्लाइकन वितरण चिकित्सीय एंटीबॉडी की सही संरचना का प्रतिनिधित्व नहीं कर सकता है। इसलिए, एंटीबॉडी और एंटीबॉडी फ़्यूज़न प्रोटीन और अन्य बायोथेरेप्यूटिक एजेंटों की उत्पादन प्रक्रिया के दौरान ग्लाइकोसिलेशन निगरानी के लिए जितनी जल्दी हो सके एक सटीक एन-ग्लाइकन प्रोफ़ाइल प्राप्त करना महत्वपूर्ण है।

फास्ट पीएनजीएएस एफ

फास्ट पीएनजीएज एफ एक अनुकूलित पुनः संयोजक अभिकर्मक है जो कुछ ही मिनटों में एंटीबॉडी, इम्युनोग्लोबुलिन, फ्यूजन प्रोटीन और अन्य ग्लाइकोप्रोटीन को तेजी से और पूरी तरह से डीग्लाइकोसिलेट कर सकता है। यह एंजाइम जल्दी और बिना किसी वरीयता के सभी एन-ग्लाइकन को हटा सकता है और इसका उपयोग सीधे डाउनस्ट्रीम क्रोमैटोग्राफी या मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए किया जा सकता है। येसेन फास्ट पीएनजीएज एफ, एन-ग्लाइकोसिडेस एफ (फास्ट वर्जन) प्रयोगात्मक प्रक्रिया को सरल बनाता है, संवेदनशीलता और दोहराव सुनिश्चित करते हुए प्रयोगात्मक समय को कम करता है।

उत्पाद की विशेषताएँ:

तेज़: कुछ ही मिनटों में पूर्ण एवं तीव्र डीग्लाइकोसिलेशन।

उच्च शुद्धता: कोई प्रोटीएज़, ग्लाइकोसिडेज़ संदूषण नहीं, शुद्धता ≥95%.

गैर-चयनात्मक: शीघ्रता से और बिना किसी वरीयता के सभी एन-ग्लाइकेन को हटा दें।

अच्छी संगतता: सीधे डाउनस्ट्रीम क्रोमैटोग्राफी या मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए उपयोग किया जाता है।

परीक्षण डेटा:

एक-चरण प्रोटीन डीग्लाइकोसिलेशन:

1. 10 ug सब्सट्रेट/100 ug एंटीबॉडी और ddH2O को 16 uL की कुल मात्रा में मिलाया गया;
2. 4 μL फास्ट PNGase F बफर (5x) जोड़ें, अंतिम मात्रा 20 uL;
3. 1 μL फास्ट पीएनजीएज़ एफ मिलाएं।
4. 50°C पर 10 मिनट तक रखें।

1: प्रोटीन मार्करकैट#20350ES) 2: प्रतियोगी + सब्सट्रेट या एंटीबॉडी 3: प्रतियोगी + सब्सट्रेट या एंटीबॉडी 4: येसेन फास्ट पीएनजीएएसई एफ 5: येसेन फास्ट पीएनजीएज़ एफ6: सब्सट्रेट या एंटीबॉडी 7: येसेन फास्ट पीएनजीएज़ एफ 8: प्रतियोगी

दो-चरणीय प्रोटीन डीग्लाइकोसिलेशन:

1. 10 ug सब्सट्रेट/100 ug एंटीबॉडी और ddH2O को 16 uL की कुल मात्रा में मिलाया गया;
2. 4 μL फास्ट PNGase F बफर (5x) जोड़ें, अंतिम मात्रा 20 uL;
3. 80°C पर 2 मिनट तक रखें, फिर कमरे के तापमान तक ठंडा करें।
4. 1 μL फास्ट पीएनजीएज़ एफ मिलाएं।
5. 50°C पर 10 मिनट तक रखें।

चित्र 3. दो-चरणीय एंजाइमेटिक क्लीवेज प्रभाव प्रोटीन सब्सट्रेट (ए) और एंटीबॉडी (बी) पर।

1: प्रोटीन मार्करकैट#20350ES) 2: प्रतियोगी + सब्सट्रेट या एंटीबॉडी 3: प्रतियोगी + सब्सट्रेट या एंटीबॉडी 4: येसेन फास्ट पीएनजीएएसई एफ 5: येसेन फास्ट पीएनजीएज़ एफ6: सब्सट्रेट या एंटीबॉडी 7: येसेन फास्ट पीएनजीएज़ एफ 8: प्रतियोगी

निष्कर्ष:

1. यीसेन फास्ट पीएनजीएएस एफ में समान प्रतिक्रिया स्थितियों के तहत आयातित प्रतिस्पर्धियों के समान या उच्च एंजाइमेटिक क्लीवेज दक्षता है;
2. उच्च एंजाइमी क्लीवेज दक्षता सुनिश्चित करने के लिए दो-चरणीय एंजाइमी क्लीवेज करने की अनुशंसा की जाती है। कुछ एंटीबॉडी (जैसे कि फैब एन-ग्लाइकोसिलेशन) को प्रीहीटिंग चरण की आवश्यकता होती है

कुशल डीग्लाइकोसिलेशन के लिए।

इसके अलावा, येसेन नियमित PNGase F (Cat#20407ES, विशिष्ट गतिविधि: 100000 U/mL), और अन्य प्रकार के ग्लाइकोसिडेस भी प्रदान करता है, जैसे एंडो H ग्लाइकोसिडेस H (Cat#20414ES), एंडो S ग्लाइकोसिडेस S (Cat#20413ES)।

खरीद गाइड

उत्पाद संख्या	20406ईएस	20407ईएस	20414ईएस	20413ईएस
प्रोडक्ट का नाम	तेज़ पीएनजीएएसई एफ	पीएनजीएएसई एफ	एंडो एच	एंडो एस
स्रोत	यीस्ट पुनः संयोजक अभिव्यक्ति	यीस्ट पुनः संयोजक अभिव्यक्ति	यीस्ट पुनः संयोजक अभिव्यक्ति	ई कोलाई पुनः संयोजक अभिव्यक्ति
विशिष्ट गतिविधि	लागू नहीं	100000यू/एमएल	1000000यू/एमएल	8000 यू/एमजी
दरार स्थल	लगभग सभी एन-लिंक्ड ग्लाइकेन	लगभग सभी एन-लिंक्ड ग्लाइकेन	एन-लिंक्ड उच्च मैनोज़ ग्लाइकन्स	IgG भारी श्रृंखला की कोर डाइसैकेराइड संरचना के भीतर विदलित होता है
पाचन समय	10 मिनट	1-3 घंटे	1-3 घंटे	1 घंटा
ग्लाइकोसिलेशन	उपयुक्त	उपयुक्त	उपयुक्त	उपयुक्त
प्रोटीन संरचना	उपयुक्त	उपयुक्त	उपयुक्त	उपयुक्त

आदेश की जानकारी

प्रोडक्ट का नाम	उत्पाद संख्या	विनिर्देश
फास्ट पीएनजीएएस एफ (ग्लिसरोल-मुक्त)	20406ईएस20/50	20 टी/50 टी
पीएनजीएएसई एफ	20407ईएस01/02	15000 यू /75000 यू
एंडो एच	20414ईएस92/97	10000 यू /50000 यू
एंडो एस	20413ईएस80/90	1000 यू/5 x 1000 यू