टेलन टेलोमेरेज़: डीएनए एंजाइमेटिक सिंथेसिस में एक नई ड्राइव

जब बात टेलोमेरेस और प्रोटेलोमेरेज़ की आती है जीव विज्ञान में, लोगों के दिमाग में अक्सर सबसे पहले उम्र बढ़ने का ख्याल आता है, जो एक अपरिहार्य प्राकृतिक घटना है। है यूकेरियोटिक गुणसूत्रों के सिरों पर दोहराए जाने वाले डीएनए अनुक्रम, जो धारण करते हैं गुणसूत्र अखंडता को बनाए रखने और कोशिका विभाजन चक्र को विनियमित करने की जिम्मेदारी।

प्रोटेलोमेरेज़ यह एक रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस डीएनए संश्लेषण एंजाइम है जो टेलोमेरेस को बढ़ाता है। यह आरएनए और प्रोटीन से बना एक न्यूक्लियोप्रोटीन है। प्रोटीन घटक टेलोमेर पुनरावृत्ति अनुक्रमों के संश्लेषण को उत्प्रेरित कर सकता है आरएनए घटक के साथ.

चित्र 1. प्रोटेलोमेरेज़-मध्यस्थ टेलोमेर विस्तार का तंत्र^[1]

प्रोटेलोमेरेज़ टेलोमेरेस की मरम्मत और लंबाई बढ़ा सकते हैं, डीएनए प्रतिकृति में दोषों की भरपाई कर सकते हैं, कोशिका विभाजन के दौरान टेलोमेरेस की हानि को रोक सकते हैं और कोशिका विभाजन की संख्या बढ़ा सकते हैं। 2009 में, फिजियोलॉजी या मेडिसिन में नोबेल पुरस्कार एलिजाबेथ एच ब्लैकबर्न, कैरोल डब्ल्यू ग्रीडर और जैक डब्ल्यू सोजस्टक को टेलोमेरेस और प्रोटेलोमेरेस की महत्वपूर्ण भूमिका को उजागर करने में उनके उत्कृष्ट योगदान के लिए दिया गया था। कोशिकीय कार्य और उम्र बढ़ने में।

आज, मैं आपको एक अनोखे प्रोटेलोमेरेज़ से परिचित कराना चाहता हूँ: टेलएन प्रोप्रोटेलोमेरेज़। टेलएन प्रोटेलोमेरेज़ बैक्टीरियोफेज N15 से आता है और N15 प्रतिकृति प्रणाली का एक घटक है, भाग लेता है रैखिक प्रोफेज डीएनए की पीढ़ी में। प्रोटेलोमेरेज़ के विपरीत यूकेरियोट्स में, TelN बिना किसी RNA घटक के एक शुद्ध प्रोटीन एंजाइम है। इसमें दरार-बंधन होता है यह क्रियाकलाप को बाधित करता है तथा दोहरे-रज्जुक वाले डीएनए (डीएसडीएनए) को काटने के बाद विदलन स्थल पर एक सहसंयोजक रूप से बंद सिरा छोड़ देता है।

चित्र 2. टेलएन प्रोटेलोमेरेज़ दरार स्थल

टेलएन प्रोटेलोमेरेज़ कार्रवाई की प्रणाली

टेल्न प्रोटेलोमेरेज़ की पहचान स्थल यह एक पैलिंड्रोम अनुक्रम है जो 56 बीपी लंबा है, जिसके दोनों ओर टेलआर और टेलएल हैं। लक्ष्य अनुक्रम की केंद्रीय स्थिति भी एक पैलिंड्रोम अनुक्रम टेलओ है। टेलएन प्रोटेलोमेरेज़ टेलो अनुक्रम के भीतर विभाजित हो जाता है और दो विभाजन सिरों पर एक सहसंयोजक रूप से बंद हेयरपिन संरचना बनाता है। पाचन के बाद डीएनए का अंत अभी भी टेलआर और टेलएल से बना होता है, जिसे के रूप में जाना जाता है डॉगीबोन डीएनए (डीबीडीएनए).

चित्र 3. प्रोटेलोमेरेज़ टेल्न साइट पर दरार तंत्र^[2]

टेलएन प्रोटेलोमेरेज़ की विशेष एंजाइम क्लीवेज-लिगेशन गतिविधि के कारण, गोलाकार प्लास्मिड डीएनए को एक-चरण एंजाइमेटिक प्रतिक्रिया के माध्यम से रैखिक सहसंयोजक रूप से बंद डंबल के आकार के अणुओं में परिवर्तित किया जा सकता है। रैखिक खुले डीएनए अणुओं की तुलना में, रैखिक बंद डीएनए में कोशिकाओं में उच्च प्रोटीन अभिव्यक्ति स्तर होता है, जो उच्च स्थिरता और न्यूनतम विदेशी अनुक्रम के साथ रैखिक बंद अंत मिनी डीएनए के निर्माण के लिए बहुत उपयुक्त है। प्लास्मिड डीएनए mRNA वैक्सीन, डीएनए वैक्सीन और सेल जीन थेरेपी के मुख्य तत्व के रूप में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। पारंपरिक प्लास्मिड उत्पादन विधि में किण्वन शामिल है ई कोलाई और बहु-चरण प्रवर्धन, और किण्वन प्रक्रिया में अनियंत्रित जोखिम उच्च गुणवत्ता वाले प्लास्मिड की उपज को सीमित करता है, जो टीकों की उत्पादन क्षमता को सीमित करने की कुंजी बन जाता है। यू.के. में टचलाइट कंपनी ने एक अभिनव dbDNA तकनीक शुरू की है। यह तकनीक प्लास्मिड डीएनए तैयार करने के लिए बैक्टीरियल किण्वन की पारंपरिक विधि को बाधित करती है और इसके बजाय डीएनए के इन विट्रो एंजाइमेटिक संश्लेषण का उपयोग करती है। उपरोक्त विधि में रैखिक बंद-अंत मिनी डीएनए उत्पन्न करने के लिए टेलएन प्रोटेलोमेरेज़ की विशेष एंजाइम क्लीवेज-लिगेशन गतिविधि का भी उपयोग किया जाता है।

डीएनए एंजाइमेटिक संश्लेषण में टेलएन प्रोटेलोमेरेज़ का अनुप्रयोग

फाई29 डीएनए पॉलीमरेज़ और टेलएन प्रोटेलोमेरेज़ पर आधारित डीएनए इन विट्रो एंजाइमेटिक विधि जैविक किण्वन प्रक्रिया में कई अनियंत्रित जोखिमों से बच सकती है, और इन विट्रो एंजाइमेटिक विधि तेज़ गति और उच्च उपज के साथ डीएनए को संश्लेषित कर सकती है। संश्लेषित डीएनए का उपयोग कई उभरती प्रौद्योगिकियों में किया जा सकता है, जैसे कि mRNA वैक्सीन, डीएनए वैक्सीन, जीन थेरेपी वेक्टर और जीन एडिटिंग।

चित्र 4. डीएनए एंजाइमेटिक संश्लेषण का फ्लोचार्ट^[3]

एंजाइमेटिक डीएनए संश्लेषण प्रक्रिया

1. टेम्पलेट विकृतीकरण

वृत्ताकार प्लास्मिड डीएनए टेम्पलेट को विकृतीकरण प्रक्रिया द्वारा दो एकल-रज्जुक वाले वृत्ताकार डीएनए में परिवर्तित कर दिया जाता है।

2. रोलिंग सर्किल प्रवर्धन

प्रोटेलोमेरेज़ पहचान अनुक्रम अंतराल के साथ लंबे रैखिक डबल-स्ट्रैंडेड कॉन्कैटेमेरिक डीएनए उत्पन्न करने के लिए फाई29 डीएनए पॉलीमरेज़ और सिंगल-स्ट्रैंडेड सर्कुलर डीएनए का उपयोग करके रोलिंग सर्कल प्रवर्धन किया गया।

3. काटना और सहसंयोजक बंद करना

टेलएन प्रोटेलोमेरेज़ टेलोमेरिक कॉम्प्लेक्स के डीएनए पर टेलआरएल को पहचानता है, और रैखिक, सहसंयोजक रूप से जुड़े डीएनए मोनोमर्स को उत्पन्न करने के लिए दरार-बंधन गतिविधियों को निष्पादित करता है।

4. जीवाणु बैकबोन डीएनए को हटाना

प्रतिबंध एंडोन्यूक्लिअस या एक्सोन्यूक्लिअस बैक्टीरिया के कंकाल डीएनए को अंत में एक खुली संरचना के साथ नष्ट कर देते हैं ताकि केवल लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति तत्वों वाले डीएनए प्राप्त हो सकें। डीएनए प्रौद्योगिकी के एंजाइमेटिक संश्लेषण जैविक किण्वन को बायपास करते हैं और जीएमपी-स्तर प्लास्मिड डीएनए संश्लेषण को जल्दी से प्राप्त कर सकते हैं, जीन थेरेपी और mRNA टीकों के क्षेत्र में उत्पादन क्षमता की सीमाओं को हल कर सकते हैं। यह औद्योगिकीकरण के लिए बहुत बड़ी क्षमता रखता है। डीएनए एंजाइमेटिक संश्लेषण प्रौद्योगिकी के विकास को बढ़ावा देने के लिए, YEASEN जीवविज्ञान डीएनए एंजाइमेटिक संश्लेषण के लिए कोर एंजाइम सामग्री प्रदान कर सकता है, जैसे कि phi29 डीएनए पोलीमरेज़ (14404ES) और TelN प्रोटेलोमेरेज़ (14540ES), डीएनए एंजाइमेटिक संश्लेषण प्रौद्योगिकी के अनुसंधान और उत्पादन में सहायता करने के लिए।

पीप्रदर्शन प्रस्तुति येसेन का टेलएन प्रोटेलोमेरेज़

1. क्लीवेज-लिगेशन प्रदर्शन उत्कृष्ट है, जो आयातित ब्रांडों के बराबर है।

एक टेम्पलेट के रूप में टेलएन प्रोटेलोमेरेज़ पहचान साइट युक्त सुपरकोइल प्लास्मिड का उपयोग करते हुए, YEASEN से ग्रेडिएंट एडिशन (0.078-5 U) एंजाइम और ब्रांड A को जोड़ा गया। सुपरकोइल प्लास्मिड के 0.5 μg को बंद रैखिक डबल स्ट्रैंडेड डीएनए (dsDNA) में परिवर्तित किया गया। रूपांतरण दक्षता का पता लगाने के लिए जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस का उपयोग किया गया, और परिणामों से पता चला कि YEASEN के टेलएन प्रोटेलोमेरेज़ की दरार और बंधन गतिविधि ब्रांड A के बराबर थी।

चित्र 5. टेलएन एम: मार्कर, सी: सुपरकोइल्ड प्लास्मिड नियंत्रण के प्रोटेलोमेरेज़ क्लीवेज गतिविधि का पता लगाना

2. रैखिक dsDNA की बंद अखंडता > 90%

टेलएन प्रोटेलोमेरेज़ पहचान स्थल वाले सुपरकोइल प्लास्मिड को टेम्पलेट के रूप में इस्तेमाल करते हुए, YEASEN और ब्रांड A के टेलएन प्रोटेलोमेरेज़ को जोड़ते हुए, सुपरकोइल प्लास्मिड के 0.5 μg को बंद रैखिक dsDNA में परिवर्तित किया गया, और बैंड डिग्रेडेशन डिग्री के माध्यम से इसकी अंतिम अखंडता का पता लगाने के लिए T5 एक्सोन्यूक्लिएज़ को जोड़ा गया। परिणामों से पता चला कि YEASEN के TleN प्रोटेलोमेरेज़ द्वारा उत्पन्न dsDNA अंत बंद अखंडता > 90% थी, जो ब्रांड A के बराबर थी।

चित्र 6. टेलएन प्रोटेलोमेरेज़ अंत बंद अखंडता परीक्षण। C1: टेलएन पहचान स्थल युक्त प्लास्मिड, टेलएन प्रोटेलोमेरेज़ के बिना; C2: टेलएन पहचान स्थल युक्त प्लास्मिड, टेलएन प्रोटेलोमेरेज़, T5 एक्सोन्यूक्लिऐस के बिना; प्लास्मिड: टेलएन पहचान स्थल युक्त प्लास्मिड।

संबंधित उत्पाद का डीएनए एंजाइमेटिक संश्लेषण

उत्पाद वर्गीकरण	प्रोडक्ट का नाम	सूची क्रमांक.
प्रोटेलोमेरेज़	टेलएन प्रोटेलोमेरेज़ (5 यू/μएल)	14540ईएस
फी29 डीएनए पोलीमरेज़	phi29 डीएनए पॉलीमरेज़ (10 U/μL)	14404ईएस
एक्सोन्यूक्लिऐस	एक्सोन्यूक्लिऐस III	14525ईएस
	टी5 एक्सोन्यूक्लिऐस (10 यू/µएल)	14538ईएस
डीएनटीपी	dNTP मिश्रण (25 mM प्रत्येक)	10125ईएस

आरसंदर्भ

[1] जिआर्डिनी एमए, सेगाट्टो एम, दा सिल्वा एमएस, नून्स वीएस, कैनो एमआई। टेलोमेरे और प्रोटेलोमेरेज़ जीवविज्ञान. प्रोग मोल बायोल ट्रांसल साइंस. 2014;125:1-40.

[2] हेनरिक जे, शुल्ट्ज़ जे, बोस एम, ज़ीगेलिन जी, लंका ई, मोलिंग के. प्रोकैरियोटिक क्लीविंग-ज्वाइनिंग एंजाइम टेलएन द्वारा उत्पन्न रैखिक बंद मिनी डीएनए स्तनधारी कोशिकाओं में कार्यात्मक है। जे मोल मेड (बर्ल)। 2002;80(10):648-654।

[3] हेनरिक जे, शुल्ट्ज़ जे, बोस एम, ज़ीगेलिन जी, लंका ई, मोलिंग के. प्रोकैरियोटिक क्लीविंग-ज्वाइनिंग एंजाइम टेलएन द्वारा उत्पन्न रैखिक बंद मिनी डीएनए स्तनधारी कोशिकाओं में कार्यात्मक है। जे मोल मेड (बर्ल)। 2002;80(10):648-654. doi:10.1007/s00109-002-0362-2.