जैव प्रौद्योगिकी के तेजी से विकास के साथ, एक उभरती हुई उपचार पद्धति के रूप में mRNA थेरेपी ने अपनी मजबूत प्रोग्रामेबिलिटी और तेज प्रतिक्रिया गति के कारण बहुत ध्यान आकर्षित किया है। mRNA वैक्सीन और जीन थेरेपी के क्षेत्र में, उच्च गुणवत्ता वाले mRNA को कुशलतापूर्वक संश्लेषित करना चिकित्सीय लक्ष्यों को प्राप्त करने में एक महत्वपूर्ण कदम है। इस प्रक्रिया के दौरान, T7 RNA पोलीमरेज़ (T7 RNAP) एक आवश्यक भूमिका निभाता है, यह mRNA के इन विट्रो संश्लेषण को कुशलतापूर्वक उत्प्रेरित कर सकता है।
हालांकि T7 RNAP mRNA संश्लेषण में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, लेकिन व्यवहार में यह अक्सर एक उपोत्पाद के रूप में डबल-स्ट्रैंडेड RNA (dsRNA) का उत्पादन करता है। dsRNA कई वायरस की पहचान में से एक है, और इसलिए इसे इंट्रासेल्युलर dsRNA-बाइंडिंग प्रोटीन द्वारा आसानी से पहचाना जाता है, जो जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं और भड़काऊ प्रतिक्रियाओं को ट्रिगर करता है। इसका मतलब यह है कि अगर mRNA फॉर्मूलेशन में dsRNA का उच्च स्तर होता है, तो यह अनावश्यक प्रतिरक्षा सक्रियण को जन्म दे सकता है, जो चिकित्सीय प्रभावकारिता को प्रभावित कर सकता है या गंभीर दुष्प्रभाव पैदा कर सकता है। अत्यधिक dsRNA mRNA के सामान्य कार्य में भी हस्तक्षेप कर सकता है, जिसमें अनुवाद दक्षता और mRNA स्थिरता शामिल है, जो अप्रत्यक्ष रूप से mRNA थेरेपी की प्रभावशीलता को प्रभावित करता है।
चित्र 1: डीएसआरएनए उपोत्पादों का प्रभाव और अनुकूलित टी7 आरएनएपी प्रतिक्रिया।
इसलिए, dsRNA की उत्पत्ति को कम करने के लिए प्रभावी तरीकों को विकसित करना और अपनाना mRNA प्रौद्योगिकी विकास का एक महत्वपूर्ण हिस्सा है। शोधकर्ताओं ने विभिन्न रणनीतियाँ विकसित की हैं, जिनमें बेहतर T7 RNA पॉलीमरेज़, संशोधन न्यूक्लियोटाइड, IVT ट्रांसक्रिप्शन बफ़र्स का अनुकूलन और डाउनस्ट्रीम शुद्धिकरण प्रक्रियाएँ शामिल हैं। येसेन बायोलॉजी अपने ज़ाइमएडिटर निर्देशित विकास प्लेटफ़ॉर्म की क्षमताओं का उपयोग mRNA इन विट्रो संश्लेषण के लिए मुख्य एंजाइम कच्चे माल - T7 RNA पॉलीमरेज़ को लगातार विकसित करने के लिए करती है। हमने एक निम्न dsRNA T7 RNA पॉलीमरेज़ विकसित किया है जो T7 RNA पॉलीमरेज़ की RDRP गतिविधि को दबाता है, मूल रूप से dsRNA के निर्माण को कम करता है, जिससे dsRNA की मात्रा में उल्लेखनीय कमी आती है।
उत्पाद डेटा
उपज: 9 मिलीग्राम/एमएल से अधिक
डीएसआरएनए सामग्री: डीएसआरएनए की सामग्री कम से कम 10 गुना तक महत्वपूर्ण रूप से कम हो गई है
कैपिंग दक्षता: 99% से अधिक
कम डीएसआरएनए टी7 आरएनए पोलीमरेज़ स्क्रीनिंग प्रक्रिया:
1) एक यादृच्छिक लाइब्रेरी और FADS उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग विधि का निर्माण, 10 से अधिक की एक यादृच्छिक उत्परिवर्तन लाइब्रेरी^6 स्क्रीनिंग की गई।
2) साइट-संतृप्त लाइब्रेरी को स्क्रीन करने के लिए अर्ध-तर्कसंगत डिजाइन और माइक्रोप्लेट तकनीक का उपयोग किया गया। दोनों तरीकों से कम dsRNA T7 RNA पॉलीमरेज़ म्यूटेंट प्राप्त हुए। dsRNA सामग्री पर विचार करते हुए यह सुनिश्चित किया गया कि अन्य संकेतक कम न हों (जैसे अखंडता/कैपिंग दक्षता/उपज, आदि), कई उत्परिवर्ती का चयन किया गया और क्लीएस्क्रिप™ टी7 नामक एक उत्परिवर्ती का व्यावसायिक अनुप्रयोग के लिए उपयोग किया गया।
उत्पाद डेटा
विभिन्न लंबाई अनुप्रयोग परिदृश्यों में, कम डीएसआरएनए टी7 आरएनए पोलीमरेज़ ने डब्ल्यूटी टी7 और प्रतिस्पर्धी उत्पादों दोनों की तुलना में अत्यधिक महत्वपूर्ण कमी दिखाई है, जबकि यह सुनिश्चित किया गया है कि उपज और अखंडता कम नहीं हुई है।
| टुकड़े की लंबाई | टी7 आरएनए पोल | उपज(मिलीग्राम/एमएल） |
अखंडता(%） | डीएसआरएनए सामग्री (प्रति 1 माइक्रोग्राम आरएनए में उत्पादित डीएसआरएनए की मात्रा) |
| 4के | टी7-डब्ल्यूटी | 12.4 | 88.3 | 0.4273 |
| क्लीस्क्रिप™ टी7 | 12.1 | 89.9 | 0.0129 | |
| कंपनी ए | 11.0 | 87.8 | 0.0323 | |
| 9के | टी7-डब्ल्यूटी | 9.5 | 81.9 | 2.9180 |
| क्लीस्क्रिप™ टी7 | 9.0 | 82.0 | 0.0379 | |
| कंपनी ए | 7.2 | 78.7 | 0.1805 |
का उपयोग करते हुए 2.5 mM की कैप सांद्रता के साथ, WT की तुलना में विभिन्न खंड लंबाई में उत्कृष्ट कैपिंग दक्षता अभी भी प्राप्त की जा सकती है। इसके अतिरिक्त, सेलुलर स्तर पर बेहतर प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रदर्शन भी देखा जाता है।
| कैप एनालॉग इनपुट（मिमी） | कैपिंग दक्षता（%）4के | |
| डब्ल्यूटी | कम डीएसआरएनए | |
| 10 | 100 | 100 |
| 5 | 100 | 100 |
| 2.5 | 100 | 100 |
संयुक्त राज्य अमेरिका में पेटेंट प्रस्तुत किया गया है।
उत्पाद की जानकारी
| प्रोडक्ट का नाम | सूची की संख्या | विनिर्देश | आयतन |
| क्लीस्क्रिपटीएम टी7 आरएनए पोलीमरेज़ (कम डीएसआरएनए, 250 यू/μL) | 10628ईएस | 100 /2500 /25,000केयू | 400 μL/10 एमएल/100 एमएल |
| क्लीस्क्रिपटीएम टी7 आरएनए पोलीमरेज़ जीएमपी-ग्रेड (कम डीएसआरएनए, 250 यू/μL) | 10629ईएस | 100 /2500 /25,000केयू | 400 μL/10 एमएल/100 एमएल |