चित्र 1: इन विट्रो आरएनए प्रतिलेखन प्रक्रिया

उत्पाद लाभ

उच्च उपज: प्रतिलेखन प्रतिक्रिया के माध्यम से 2 घंटे में 200 μg तक उत्पादन कर सकते हैं

बेहतर बहुमुखी प्रतिभा: 20nt-10000nt आरएनए के प्रतिलेखन के लिए उपयुक्त

उत्कृष्ट प्रदर्शन: आईवीटी प्रक्रिया के दौरान प्रतिलेखन के उपोत्पादों को प्रभावी ढंग से कम करना

एकाधिक अनुप्रयोग: साधारण, लेबलयुक्त और संशोधित आरएनए संश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है

उत्पाद गुण

चित्र 2: विभिन्न लम्बाई की प्रतिलिपियों की प्राप्ति

चित्र 3: विभिन्न लम्बाई की प्रतिलिपियों की गुणवत्ता

चित्र 4: की अभिव्यक्ति लिखित एमआरएनए में एचईके-293 कोशिकाओं

नोट: mRNA को वैक्सीनिया कैपिंग एंजाइम (येसेन#10614/10615) के साथ कैप किया गया है।

प्रयोगात्मक विधियों

विगलन अभिकर्मक

T7 RNA पोलीमरेज़ मिक्स को थोड़ी देर के लिए सेंट्रीफ्यूज करें और रखें यह बर्फ पर। 10×ट्रांसक्रिप्शन बफर और राइबोन्यूक्लियोटाइड को पिघलाएंएस (एटीपी, सीटीपी, जीटीपी, यूटीपी), मिश्रण करें और ट्यूब के नीचे सेंट्रीफ्यूज करें, कमरे के तापमान पर 10 × ट्रांसक्रिप्शन बफर रखें, और बर्फ पर 4 प्रकार के राइबोन्यूक्लियोटाइड रखें।

बी।कमरे के तापमान पर असेंबली प्रतिलेखन प्रतिक्रिया

निम्नलिखित प्रणाली के अनुसार प्रतिक्रिया प्रणाली तैयार करें:

अवयव	आयतन (µL)	अंतिम सांद्रता
आरएनज़ मुक्त एच2हे	20 तक	-
10×ट्रांसक्रिप्शन बफर	2	1×
सीटीपी / जीटीपी / एटीपी / यूटीपी (प्रत्येक 100 एमएम)	2 प्रत्येक	10 मिमी प्रत्येक
टेम्पलेट डीएनए	1 माइक्रोग्राम	-
टी7 आरएनए पोलीमरेज़ मिक्स	2	-

टिप्पणियाँ:

1. प्रतिक्रिया कमरे के तापमान पर कॉन्फ़िगर की जाती है। चूंकि 10× ट्रांसक्रिप्शन बफर में स्पर्मिडीन होता है, इसलिए स्पर्मिडीन की उच्च सांद्रता कम तापमान पर डीएनए टेम्पलेट अवक्षेपण का कारण बन सकती है।
   लघु प्रतिलेखों (<100 nt) के लिए, 2 µg टेम्पलेट का उपयोग किया जा सकता है, प्रतिलेखन समय 4-8 hs तक बढ़ाया जा सकता है।
   3. लंबे प्रतिलेखों (>1000 एनटी) के लिए, प्रतिलेखन के लिए टेम्पलेट्स के रूप में रैखिककृत प्लास्मिड का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।
   4. वाष्पीकरण को रोकने के लिए गर्म ढक्कन खोलकर पीसीआर उपकरण में प्रतिक्रिया करें।
   5. प्रतिक्रिया उत्पाद में एक सफेद अवक्षेप हो सकता है। अवक्षेप मैग्नीशियम पाइरोफॉस्फेट है जो प्रतिक्रिया समाधान में मुक्त पाइरोफॉस्फेट और मैग्नीशियम आयन जो बाद के प्रयोगों को प्रभावित नहीं करते हैं। यदि आप इसे हटाना चाहते हैं, तो आप कुछ EDTA जोड़ सकते हैं। यदि EDTA के जोड़ से बाद के प्रयोगों पर असर पड़ता है, तो सुपरनेटेंट को सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा भी पुनर्प्राप्त किया जा सकता है।
   6. अभिकर्मकों और कंटेनरों को RNase संदूषण से मुक्त रखें।

C. 37°C पर 2 घंटे तक रखें

घटकों के घोल को मिलाएं, ट्यूब के निचले भाग में थोड़ी देर के लिए सेंट्रीफ्यूज करें, और 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। यदि ट्रांसक्रिप्ट की लंबाई 100 एनटी से कम है, तो प्रतिक्रिया समय को 4-8 घंटे तक बढ़ाएँ।

डी.डी.एन.ए.एस.ई. I उपचार (वैकल्पिक)

प्रतिक्रिया पूरी हो जाने के बाद, प्रत्येक ट्यूब में 2 μL DNase I (RNase मुक्त) डालें और टेम्पलेट DNA को निकालने के लिए 37°C पर 15 मिनट तक रखें।

अक्सर पूछे जाने वाले प्रश्नों

1. कम प्रतिलेख उपज

टेम्पलेट की गुणवत्ता का उपज से गहरा संबंध है। प्रायोगिक समूह की उपज नियंत्रण समूह की तुलना में काफी कम है। संभावित कारण ये हैं:

• प्रायोगिक टेम्पलेट में निरोधात्मक घटक होते हैं;
• टेम्पलेट में शायद कुछ गड़बड़ है.

सुझाव: ① टेम्पलेट को पुनः शुद्ध करें; ② टेम्पलेट परिमाणीकरण और इसकी अखंडता का निर्धारण करें; ③ प्रतिक्रिया समय बढ़ाएँ; ④ टेम्पलेट इनपुट की मात्रा बढ़ाएँ; ⑤ अन्य प्रमोटरों का उपयोग करें और अन्य आरएनए पॉलीमरेज़.

2. लघु प्रतिलेखों की कम उपज

छोटे टेम्पलेट टुकड़े प्रतिक्रिया को बाधित कर सकते हैं। जब प्रतिलेखन उत्पाद 100 nt से कम होता है, तो यदि आप उपज बढ़ाना चाहते हैं, तो प्रतिक्रिया समय को 4-8 hs तक बढ़ाएँ या टेम्पलेट की मात्रा को 2 μg तक बढ़ाएँ।

3. आरएनए प्रतिलेखन लंबाई है बड़ा अपेक्षा से अधिक

यदि वैद्युतकणसंचलन परिणाम से पता चलता है कि उत्पाद बैंड अपेक्षित आकार से बड़ा है, तो संभावित कारण हो सकते हैं: ①प्लाज्मिड टेम्पलेट पूरी तरह से रैखिक नहीं हो सकता है; ②सेंस स्ट्रैंड के 3' छोर में एक प्रमुख संरचना होती है; ③आरएनए में एक द्वितीयक संरचना होती है जो पूरी तरह से विकृत नहीं होती है।

सुझाव: ①जांच करें कि क्या टेम्पलेट पूरी तरह से रैखिककृत है, और यदि आवश्यक हो, तो अतिरिक्त रैखिकीकरण करें; ②3' ओवरहैंग से बचने के लिए उपयुक्त प्रतिबंध एंजाइम का चयन करें, या आगे बढ़ने से पहले प्रतिलेखन को पूरा करने के लिए क्लेनो फ्रेगमेंट / टी 4 डीएनए पोलीमरेज़ का उपयोग करें; ③आरएनए उत्पादों का पता लगाने के लिए विकृत जेल का उपयोग करें।

4. आरएनए प्रतिलेखन लंबाई है छोटे अपेक्षा से अधिक

यदि वैद्युतकणसंचलन से पता चलता है कि उत्पाद बैंड अपेक्षित आकार से छोटा है, तो संभावित कारण हैं: ①टेम्पलेट में T7 RNA पॉलीमरेज़ टर्मिनेटर के समान समाप्ति अनुक्रम होता है; ②जीसी सामग्री टेम्पलेट बहुत अधिक है.

सुझाव: ①प्रतिक्रिया तापमान कम करें (उदाहरण के लिए, 30°C)। कभी-कभी तापमान कम करने से प्रतिलेखन की लंबाई बढ़ाने में मदद मिल सकती है, लेकिन यह उपज कम करें। अन्य प्रयास करें प्रतिलेखन के लिए आरएनए पॉलीमरेज़; ②यदि टेम्पलेट जीसी सामग्री उच्च है, तो 42 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया करें, या उपज और प्रतिलेखन लंबाई बढ़ाने के लिए एसएसबी जोड़ें।

5. ट्रांस्क्रिप्शनल उत्पादों की इलेक्ट्रोफोरेटिक टेलिंग

इलेक्ट्रोफोरेसिस के दौरान टेलिंग निम्नलिखित कारणों से हो सकती है: ① प्रायोगिक ऑपरेशन के दौरान RNase संदूषण; ②डीएनए टेम्पलेट आरएनएज़ से दूषित है।

सुझाव: ①RNase मुक्त पिपेट टिप्स और EP ट्यूब का उपयोग करें, डिस्पोजेबल लेटेक्स दस्ताने और मास्क पहनें, और सभी अभिकर्मकों को RNase मुक्त H के साथ तैयार किया जाता है₂O. ②टेम्प्लेट डीएनए को पुनः शुद्ध करें।

आदेश की जानकारी

प्रोडक्ट का नाम	सूची की संख्या	एसविशिष्टता
टी7 हाई यील्ड आरएनए संश्लेषण किट	10623ईएस	50/100/500 टी
टी7 आरएनए पॉलीमरेज़ जीएमपी-ग्रेड (250 यू/μL)	10625ईएस	10केयू/100केयू/2500केयू/25एमयू
पायरोफॉस्फेटेस, अकार्बनिक जीएमपी-ग्रेड (1 यू/μL)	10620ईएस	10यू/100यू/1000यू
म्यूरिन आरएनेज़ अवरोधक जीएमपी-ग्रेड (40 यू/μL)	10621ईएस	10केयू/20केयू/100केयू/1एमयू
mRNA वैक्सीनिया कैपिंग एंजाइम जीएमपी-ग्रेड	10614ईएस	2केयू/10केयू/100केयू
mRNA कैप 2'-O-मिथाइलट्रांसफेरेज़ जीएमपी-ग्रेड	10612ईएस	10केयू/50केयू/250केयू
डीऑक्सीराइबोन्यूक्लिऐस I (DNase I) GMP-ग्रेड	10611ईएस	500/2000/10000 यू
Hieff NGS® mRNA आइसोलेशन मास्टर किट	12603ईएस	24/96 टी