MRNA प्रौद्योगिकी में CAP संरचनाओं का विकास और महत्व

कैप संरचना mRNA टीकों और चिकित्सा के विकास में एक आवश्यक घटक है। सिंथेटिक mRNA तकनीक स्थिरता, अनुवाद दक्षता को बढ़ाने और टोल-लाइक रिसेप्टर्स (TLRs) और अन्य प्रतिरक्षा सेंसर द्वारा mRNA की सहज प्रतिरक्षा पहचान को कम करने के लिए Cap1 पर निर्भर करती है, जिससे अवांछित प्रतिरक्षा सक्रियण कम से कम होता है। यह अवांछित भड़काऊ प्रतिक्रियाओं को रोकता है, जिससे मानव कोशिकाओं में चिकित्सीय mRNA की स्थिरता और प्रभावशीलता में सुधार होता है।

प्रारंभिक खोज और कैप0 संरचना

1970 के दशक के मध्य में, यूकेरियोटिक mRNA पर शोध ने 5' टर्मिनल संरचना को उजागर किया जिसे अब Cap0 के रूप में जाना जाता है, जहाँ एक N7-मेथिलगुआनोसिन कैप (m7G) 5'-अंत में पहले न्यूक्लियोटाइड से जुड़ा होता है। यह संशोधन mRNA को एक्सोन्यूक्लिअस द्वारा क्षरण से बचाने, परमाणु निर्यात में सहायता करने और अनुवाद आरंभ के लिए राइबोसोम पहचान को बढ़ावा देने के लिए पाया गया था। Cap0 पहली विशेषता वाली कैप संरचना थी, जिसका मिथाइलेशन ग्वानोसिन कैप तक ही सीमित था। इस 5'-कैप और इसके कार्यों की खोज ने यूकेरियोटिक mRNA कैप्स और mRNA संशोधनों में उनकी भूमिका को समझने में एक महत्वपूर्ण सफलता को चिह्नित किया।

कैप1 का उदय

यूकेरियोटिक mRNA की एक महत्वपूर्ण विशेषता कैप1 संरचना, mRNA स्थिरता, अनुवाद और प्रतिरक्षा पहचान में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है। एमआरएनए कैप संरचना, जिसमें 5'-5' ट्राइफॉस्फेट लिंकेज के माध्यम से पहले न्यूक्लियोटाइड से जुड़ा एक N7-मेथिलगुआनोसिन (m7G) शामिल है, 1970 के दशक में यूकेरियोटिक mRNA पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल संशोधनों पर शुरुआती अध्ययनों से विकसित हुई है।

5'-अंत कैप्ड mRNAs की संरचना।【1】 आगे की जांच से पता चला कि अधिकांश यूकेरियोटिक mRNAs में, कैप (स्थिति +1) के बाद पहला न्यूक्लियोटाइड भी राइबोज की 2'-O स्थिति पर मिथाइलेटेड होता है, एक प्रक्रिया जिसे 2'-O-मिथाइलेशन के रूप में जाना जाता है। कैप1 संरचना (m7GpppNm) के रूप में जानी जाने वाली इस खोज ने mRNA संशोधनों में कार्यात्मक महत्व की एक और परत जोड़ दी। पाया गया कि Cap1 संशोधन mRNA स्थिरता को ठीक करता है और जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली द्वारा प्रतिरक्षा पहचान को रोकता है, विशेष रूप से स्तनधारी कोशिकाओं में, जहाँ यह RIG-I, TLRs और MDA5【2】 जैसे पैटर्न पहचान रिसेप्टर्स द्वारा पहचान से बचने में मदद करता है। यह mRNA चयापचय और mRNA-आधारित तकनीकों की उन्नति, जिसमें mRNA टीकाकरण और जीन थेरेपी अनुप्रयोग शामिल हैं, दोनों के लिए महत्वपूर्ण था।

mRNA उद्योग में तकनीकी चुनौतियाँ और वर्तमान समाधान

mRNA टीकों के व्यापक अनुप्रयोग और अनुकूलन में कई तकनीकी चुनौतियाँ बनी हुई हैं, जिनमें उच्च खुराक mRNA, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, स्थिरता और वितरण से संबंधित मुद्दे शामिल हैं। mRNA उद्योग में एक महत्वपूर्ण चुनौती एक मजबूत प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्राप्त करने के लिए mRNA की उच्च खुराक की आवश्यकता है। यह कई कारकों के कारण है:

तीव्र गिरावट: mRNA स्वाभाविक रूप से अस्थिर होता है तथा जैविक प्रणालियों में उपस्थित डिकैपिंग एंजाइम्स और राइबोन्यूक्लिऐसेस (RNases) द्वारा विघटन के प्रति संवेदनशील होता है।

सीमित अनुवाद दक्षता: जिस दक्षता से mRNA को प्रोटीन में परिवर्तित किया जाता है, वह भिन्न हो सकती है, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिए पर्याप्त एंटीजन स्तर उत्पन्न करने के लिए mRNA की अधिक मात्रा की आवश्यकता होती है। अनुवाद दक्षता Cap1 और अनुवाद आरंभ कारक eIF4E की आत्मीयता से संबंधित है।

यूकेरियोट्स में मूल अनुवाद आरंभ परिसर का गठन।【3】

प्रतिरक्षाजन्यता और अवांछित प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएं: तीसरी सबसे बड़ी बाधा जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया है जिसे mRNA द्वारा ही ट्रिगर किया जा सकता है, खास तौर पर dsRNA या अपूर्ण mRNA के लिए। जबकि अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली को उत्तेजित करने के लिए प्रतिरक्षा सक्रियण का एक निश्चित स्तर वांछित है, अत्यधिक सक्रियण भड़काऊ प्रतिक्रियाओं को जन्म दे सकता है, जो वैक्सीन की प्रभावशीलता को कम कर सकता है या साइड इफेक्ट का कारण बन सकता है।

कैपिंग प्रौद्योगिकी का इतिहास

1. एंजाइमैटिक कैपिंग प्रौद्योगिकी: mRNA शोध के शुरुआती दिनों में शुरू की गई एंजाइमेटिक कैपिंग में प्राकृतिक 5' कैप पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल रूप से जोड़ने के लिए गुआनिलिलट्रांसफेरेज़ और मिथाइलट्रांसफेरेज़ जैसे कैपिंग एंजाइम का उपयोग करना शामिल है। यह विधि mRNA अनुवाद में उच्च निष्ठा और कैपिंग दक्षता सुनिश्चित करती है, विशेष रूप से चिकित्सीय अनुप्रयोगों के लिए।

2. सिंथेटिक कैप एनालॉग्स (1980-2000 के दशक): शोधकर्ताओं ने कैप्ड mRNA के इन विट्रो संश्लेषण के लिए सिंथेटिक कैप एनालॉग विकसित किए हैं, जो mRNA फ़ंक्शन और जीन अभिव्यक्ति का अध्ययन करने में मदद करते हैं। एंटी-रिवर्स कैप एनालॉग (ARCA) एक सिंथेटिक कैप एनालॉग है जिसे mRNA संश्लेषण के दौरान गलत कैप समावेशन को रोकने के लिए डिज़ाइन किया गया है, जिससे टीकों और जीन थेरेपी के लिए mRNA की अनुवाद दक्षता में सुधार होता है। हालाँकि, ARCA कैपिंग की कैपिंग दक्षता और उपज कम है।

3. कैप1 प्रौद्योगिकी (2010): ट्रिलिंक का कैप1 एक सह-ट्रांसक्रिप्शनल कैपिंग विधि है जो mRNA संश्लेषण के दौरान सीधे कैप को शामिल करके प्रक्रिया को सरल बनाती है। यह विधि दक्षता को बढ़ाती है और सही ढंग से कैप किए गए mRNA का उच्च प्रतिशत प्रदान करती है, जिससे यह mRNA टीकों जैसे बड़े पैमाने पर चिकित्सीय अनुप्रयोगों के लिए आदर्श बन जाती है।

वर्तमान में, एंजाइमैटिक कैपिंग प्रौद्योगिकियां mRNA-आधारित उपचारों के विकास में महत्वपूर्ण रही हैं, जिसमें COVID-19 टीके भी शामिल हैं, जो चिकित्सीय mRNA की स्थिरता और प्रभावी अनुवाद सुनिश्चित करते हैं।

एंजाइमैटिक कैपिंग की तुलना, अगली पीढ़ी एलजेडकैप कैपिंग और पहली पीढ़ी की कैपिंग (एआरसीए) विधि

अगली पीढ़ी के कैप एनालॉग्स का विकास

हमारा लक्ष्य डिकैपिंग एंजाइमों के प्रति प्रतिरोध, अनुवाद दक्षता में सुधार करने के लिए eIF4E के प्रति उच्च आत्मीयता और कम प्रतिरक्षाजन्यता के साथ कैप एनालॉग विकसित करना था। ये प्रगति mRNA-आधारित उपचारों की प्रभावशीलता को बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण हैं, जिसमें कैंसर विरोधी उपचार और जीन थेरेपी अनुप्रयोग शामिल हैं।

LZCap का डिज़ाइन

LZCap को डिजाइन करने में, हमने मुख्य रूप से eIF4E के लिए उच्च आत्मीयता के साथ एक कैप एनालॉग बनाने पर ध्यान केंद्रित किया। एंजाइमों में सब्सट्रेट की अपेक्षाकृत "विशिष्ट" पहचान होती है। इसलिए, एक नई कैप संरचना को डिजाइन करते समय, हम यथासंभव प्राकृतिक/ज्ञात संरचनाओं के साथ समानता बनाए रखने का प्रयास करते हैं। प्राकृतिक संरचना में एक राइबोज 3' OH होता है, जिसे संशोधित किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, मिथाइलेशन)। इस विचार के आधार पर, हमने नवीनता के लिए 3' स्थिति पर एक कार्बन जोड़ने का फैसला किया, उसके बाद OH के हाइड्रोजन बॉन्डिंग की नकल करने के लिए एक NH, और फिर NH की मूलता को कम करने और इसकी हाइड्रोजन बॉन्डिंग क्षमता को बढ़ाने के लिए एक एसिटाइल समूह जोड़ा। LZCap की गतिविधि मिथाइलेटेड प्राकृतिक कैप से बेहतर है, संभवतः बढ़ी हुई हाइड्रोजन बॉन्डिंग के कारण। मिथाइल और मेथॉक्सी समूहों की तुलना में, एसिटाइल एमिनो समूह सब्सट्रेट (कैप) और आरंभिक कारक (एंजाइम) के बीच वैन डेर वाल्स इंटरैक्शन को भी बढ़ा सकता है।

एसिटाइल एमिनो समूह की स्थिरता

एसिटाइल एमिनो समूह पहले से ही पर्याप्त रूप से स्थिर है। यह 7-मेथिलेटेड स्थिति और फॉस्फोडाइस्टर बॉन्ड की तुलना में बहुत अधिक स्थिर है, जो कैप के सबसे कम स्थिर भाग हैं।

एलजेडकैप की उपज और कैपिंग दक्षता

LZCap AG(3'Acm) कैप के साथ, ल्यूसिफ़रेज़ mRNA कैपिंग दक्षता लगभग 97.59% है, और T7 RNA पॉलीमरेज़ के साथ एक मानक इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन (IVT) प्रतिक्रिया में 1 μg DNA टेम्प्लेट के साथ 200 μg कैप्ड mRNA प्राप्त किया जा सकता है। सरल LiCl अवक्षेपण के बाद mRNA शुद्धता 99% तक होती है। यह उच्च कैपिंग दक्षता और उपज LZCap को प्रोटीन उत्पादन और जीन थेरेपी सहित विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए एक आकर्षक विकल्प बनाती है।

कैप संरचना mRNA टीकों और चिकित्सा विज्ञान के विकास में एक आवश्यक घटक है।सिंथेटिक mRNA तकनीक स्थिरता, अनुवाद दक्षता बढ़ाने के लिए Cap1 पर निर्भर करती है और टोल-लाइक रिसेप्टर्स (TLRs) और अन्य प्रतिरक्षा सेंसर द्वारा mRNA की सहज प्रतिरक्षा पहचान को कम करती है, जिससे अवांछित प्रतिरक्षा सक्रियण कम से कम होता है। यह अवांछित भड़काऊ प्रतिक्रियाओं को रोकता है, जिससे मानव कोशिकाओं में चिकित्सीय mRNA की स्थिरता और प्रभावशीलता में सुधार होता है।

उत्पाद	टोपी एजी (3'-हेमी-7एमजी)	एलजेडकैप एजी(3'एसीएम)	एजी (कोई कैपिंग नहीं)
mRNA उपज (माइक्रोग्राम)	164	173	200

RNAse H आधारित विधि से LZCapped Luciferase mRNA की कैपिंग दक्षता का MS विश्लेषण। कैपिंग दक्षता लगभग 97.59% है,

डिकैपिंग एंजाइम के प्रति mRNA स्थिरता कैसी है

LZCap AG(3'Acm) और LZCap AG M6 (3'Acm) वाले mRNAs डिकैपिंग एंजाइम (NEB) के प्रति अधिक प्रतिरोध दिखाते हैं। यह ध्यान देने योग्य है कि CapM6 (3'-OMe-6mA-7mG) भी डिकैपिंग एंजाइम के प्रति प्रतिरोधी है, लेकिन नियमित Cap AG (3'-OMe-7mG) प्रतिरोध नहीं दिखाता है।

LZCap का eIF4E से बंधन संबंध कैसा है?

LZCap AG(3'Acm) कैप्ड mRNA की प्रोटीन अभिव्यक्ति के बारे में आपका क्या कहना है?

LZCap AG(3'Acm) कैप्ड ल्यूसिफ़रेज़ mRNA की अभिव्यक्ति विभिन्न सेल लाइनों* (3T3-L1, Hela, JAWs, HEK293T और Huh7) में Cap1 एनालॉग (3'-OMe-7mG) कैप्ड mRNA की तुलना में काफी अधिक है। 130 पुनरावृत्ति प्रयोग ने औसतन (3'-OMe-7mG) कैप्ड mRNA की तुलना में LZCap AG(3'Acm) कैप्ड ल्यूसिफ़रेज़ mRNA की लगभग 1.5 गुना अधिक अभिव्यक्ति दिखाई। चूहों में भी इसी तरह का परिणाम देखा गया। प्रोटीन अभिव्यक्ति का स्तर अलग-अलग mRNA अनुक्रम के साथ थोड़ा भिन्न हो सकता है।

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LZCap AG(3'Acm) या LZCap AG(3'FMom) की अभिव्यक्ति दक्षता सीमित है

साइनोमोलगस बंदर और सूअर में कैपएजी (3'-ओएमई-7एमजी) कैप्ड एमआरएनए की तुलना में GLuc एनकोडिंग एमआरएनए उच्चतर विवो अभिव्यक्ति दर्शाता है।

एलजेडकैप एजी कैप्ड mRNAs की सहज प्रतिरक्षाजनकता के बारे में आपका क्या कहना है?

LZCapAG (3'Acm) कैप्ड mRNAs कम जन्मजात प्रतिरक्षाजननशीलता दिखाते हैं। TLR8, TLR7, IL-1A और B अनकैप्ड RNA द्वारा प्रेरित प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। LZCapped mRNA प्रतिरक्षाजननशीलता विश्लेषण के इन विवो अध्ययनों से पता चला है कि अनकैप्ड RNA ने चूहों में प्रतिरक्षा-संबंधी कारकों के प्रतिलेखन स्तर में महत्वपूर्ण परिवर्तन किए। LZCap और 3'-OMe-7mG कैप्ड mRNA दोनों ही चूहों में एक ही RNA-उत्तेजित इंजेक्शन के बाद समान कम प्रतिरक्षा कारक प्रतिलेखन स्तर प्रदर्शित करते हैं।

क्या आपने कोई सुरक्षा परीक्षण किया?

हां, हमने साइटोटॉक्सिसिटी टेस्ट, ह्यूमन पॉलीमरेज़ इनहिबिशन स्टडी और एम्स टेस्ट किया।

1. 293T、Huh7、MRC5、THP1 और U87MG कोशिकाओं में 3'-Acm-7mG（CC50＞10000nM） के न्यूक्लियोसाइड मोनोमर के लिए कोई या बहुत कम साइटोटॉक्सिसिटी देखी गई है।
2. मानव डीएनए पोलीमरेज़ ( α ,β , γ और क्लेनो) और माइटोकॉन्ड्रियल आरएनए पोलीमरेज़ (एचपीओएलआरएमटी) गतिविधि अवरोध अध्ययन से पता चलता है कि 3'-एसीएम-7एमजी टीपी मानव डीएनए या आरएनए पोलीमरेज़ को बाधित नहीं करता है।
3. बैक्टीरियल रिवर्स म्यूटेशन टेस्ट (एम्स) अधिकांश कृन्तकों और मनुष्यों में संबंधित आनुवंशिक परिवर्तनों के साथ-साथ जीनोटॉक्सिक कार्सिनोजेन्स का पता लगाता है। एम्स परीक्षण से पता चला कि 3'-Acm-7mG में कोई जीनोटॉक्सिसिटी नहीं है।

क्या इस उत्पाद का पेटेंट कराया गया है?

हाँ, पेटेंट अमेरिका में प्रदान किया गया है।

आदेश की जानकारी

प्रोडक्ट का नाम	विशेष विवरण	सूची क्रमांक.
एलजेडकैप एजी(3'एसीएम)（ 100 एमएम）	100μएल, 1एमएल	10684ईएस
एलजेडकैप एयू(3'एसीएम)（ 100 मिमी）	100μL, 1एमएल	10685ईएस
एलजेडकैप जीजी(3'एसीएम)（ 100 एमएम）	100μएल, 1एमएल	10686ईएस
एलजेडकैप एजी(3'Ma-Cy5)（ 25 मिमी）	100μL, 1एमएल	10688ईएस
एलजेडकैप एजी(3'Ma-Cy7)（ 25 मिमी）	100μL, 1एमएल	10689ईएस
एलजेडकैप (एजी(3'Ma-Cy3) (25 मिमी)	100μL, 1एमएल	10687ईएस
एलजेडकैप (एजी(3'एमए-बायोटिन) (25 एमएम)	100μL, 1एमएल	जाँच करना
LZCap (AG(3'Ma-Peg5-FAM) (25 मिमी)	100μएल, 1एमएल	जाँच करना
LZCap (AG(3'Ma-C6-MANT) (25 मिमी)	100μएल, 1एमएल	मैंजांच
एलजेडकैप (एजी(3'एसीएम) फायरफ्लाई ल्यूक एमआरएनए (1μg/μL)	100μएल, 1एमएल	मैंजांच
एलजेडकैप (एजी(3'एसीएम) ईजीएफपी एमआरएनए (1μg/μL)	100μL, 1एमएल	मैंजांच
एलजेडकैप (एजी(3'एसीएम) ईजीएफपी साआरएनए (1μg/μL)	100μL, 1एमएल	मैंजांच
एलजेडकैप (एजी(3'एसीएम) आरएफपी एमआरएनए (1 μg/μL)	100μL, 1एमएल	जाँच करना
एलजेडकैप (एजी(3'एसीएम) कैस9 एमआरएनए (1μg/μL)	100μL, 1एमएल	मैंजांच
एलजेडकैप (एजी(3'एसीएम) ग्लूकोज एमआरएनए (1μg/μL)	100μL, 1एमएल	मैंजांच

संदर्भ:

1. कोरोनावायरस आरएनए कैपिंग और मिथाइलेशन के आणविक तंत्र, वायरोलॉजिका सिनिका 31(1)

2. mRNA टीके - टीका विज्ञान में एक नया युग। नैट. रिव. ड्रग. डिस्कोव. 17, 261–279 (2018)।
3. स्तनधारियों में आरएनए-बाइंडिंग प्रोटीन द्वारा विनियमित अनुवाद आरंभ: ट्रांस-एक्टिंग कारकों, कोशिकाओं द्वारा अनुवाद आरंभ परिसर का मॉड्यूलेशन 2021, 10(7), 1711