टी7 हाई यील्ड आरएनए संश्लेषण किट प्रतिलेखन प्रतिक्रिया प्रणाली को अनुकूलित करता है। किट T7 RNA पॉलीमरेज़, टेम्पलेट के रूप में T7 प्रमोटर अनुक्रम के साथ रैखिक डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए और प्रमोटर के डाउनस्ट्रीम डीएनए अनुक्रम को नियंत्रित करने के लिए सब्सट्रेट के रूप में NTPs का उपयोग करके एकल-स्ट्रैंडेड RNA को कुशलतापूर्वक संश्लेषित कर सकता है। प्रतिलेखन के दौरान, बायोटिन या डाई-लेबल वाले RNA को तैयार करने के लिए सब्सट्रेट में संशोधित न्यूक्लियोटाइड्स को जोड़ा जा सकता है।

1. टी7 हाई यील्ड आरएनए सिंथेसिस किट का परिचय
2. सिद्धांत कृत्रिम परिवेशीय TRANSCRIPTION
3. येसेन टी7 हाई यील्ड आरएनए सिंथेसिस किट के लाभ
4. उत्पाद प्रदर्शन
5. इस किट का उपयोग कैसे करें
6. अक्सर पूछे जाने वाले प्रश्न
7. ऑर्डरिंग जानकारी

1. टी7 हाई यील्ड आरएनए सिंथेसिस किट का परिचय

T7 हाई यील्ड RNA सिंथेसिस किट लंबी ट्रांसक्रिप्ट और छोटी ट्रांसक्रिप्ट दोनों को संश्लेषित कर सकता है, और 1 μg DNA टेम्प्लेट इनपुट के साथ 100-200 μg RNA का उत्पादन किया जा सकता है। संश्लेषित RNA का उपयोग विभिन्न डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए किया जा सकता है, जैसे RNA संरचना और कार्य अनुसंधान, RNase सुरक्षा, जांच संकरण, RNA हस्तक्षेप, माइक्रोइंजेक्शन, और कृत्रिम परिवेशीय अनुवाद.

2. सिद्धांत कृत्रिम परिवेशीय TRANSCRIPTION

चित्र 1. कृत्रिम परिवेशीय प्रतिलेखन प्रक्रिया

3. येसेन टी7 हाई यील्ड आरएनए सिंथेसिस किट के लाभ

अत्यंत उच्च पैदावार - 2 घंटे में 200 µg तक
बहुमुखी - 20nt-10000nt RNA प्रतिलेखों के लिए उपयुक्त
बहुउपयोगी उपयोग - लेबल रहित, लेबल युक्त या कैप्ड आरएनए उत्पन्न करता है

4. उत्पाद प्रदर्शन

चित्र 2. आईवीटी उपज तुलना

नोट: सभी प्रतिक्रिया अभिकर्मक हैं टी7 आरएनए संश्लेषण किट (येसेन#10623 या बी* कंपनी)। येसेन और बी* कंपनी की आईवीटी प्रतिक्रिया उपज ऊपर दर्शाई गई है।

चित्र 3. विभिन्न लंबाइयों के लिए ट्रांस्क्रिप्शनल उत्पादों की गुणवत्ता

चित्र 4. HEK-293 कोशिकाओं में प्रतिलेखित mRNA का अभिव्यक्ति स्तर

नोट: mRNA को वैक्सीनिया कैपिंग एंजाइम (येसेन#10614/10615) से कैप किया गया है।

5. इस किट का उपयोग कैसे करें

5.1 विगलन अभिकर्मक

T7 RNA पॉलीमरेज़ मिक्स को थोड़ी देर के लिए सेंट्रीफ्यूज करें और बर्फ पर रखें। 10× ट्रांसक्रिप्शन बफर और राइबोन्यूक्लियोटाइड्स (ATP, CTP, GTP, UTP) को पिघलाएँ, मिलाएँ और ट्यूब के निचले हिस्से में सेंट्रीफ्यूज करें, 10× ट्रांसक्रिप्शन बफर को कमरे के तापमान पर रखें और चार प्रकार के राइबोन्यूक्लियोटाइड्स को बर्फ पर रखें।

5.2 निम्नलिखित तालिका के अनुसार प्रतिलेखन प्रतिक्रिया प्रणाली तैयार करें

तालिका नंबर एक।प्रतिलेखन प्रतिक्रिया प्रणाली की तैयारी विधि

टिप्पणी:
a) प्रतिक्रिया कमरे के तापमान पर तैयार की जाती है। चूँकि 10× ट्रांसक्रिप्शन बफर में स्पर्मिडीन होता है, इसलिए कम तापमान पर स्पर्मिडीन की सांद्रता बहुत अधिक होने से डीएनए टेम्पलेट अवक्षेपण हो जाएगा।
ख) लघु प्रतिलेख (<100 एनटी), 2 µg टेम्पलेट का उपयोग किया जा सकता है, प्रतिलेखन समय 4-8 घंटे तक बढ़ाया जा सकता है।
ग) लंबे प्रतिलेखों (> 1000 एनटी) के लिए, प्रतिलेखन के लिए रेखीयकृत प्लाज्मिड टेम्पलेट्स के उपयोग की सिफारिश की जाती है।
d) प्रतिक्रिया समाधान को लंबे समय तक वाष्पित होने से रोकने के लिए गर्म ढक्कन खोलकर पीसीआर मशीन में प्रतिक्रिया करें।
ई) प्रतिक्रिया उत्पाद में एक सफेद अवक्षेप हो सकता है। यह मैग्नीशियम पाइरोफॉस्फेट है जो प्रतिक्रिया के दौरान मुक्त पाइरोफॉस्फेट और मैग्नीशियम आयनों द्वारा बनता है, जो बाद के प्रयोगों को प्रभावित नहीं करेगा। आप इसे हटाने के लिए EDTA जोड़ सकते हैं। यदि आप चिंतित हैं कि EDTA के जुड़ने से बाद के प्रयोगों पर असर पड़ेगा, तो सुपरनेटेंट को सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा भी पुनर्प्राप्त किया जा सकता है।
च) अभिकर्मक और कंटेनर RNase संदूषण से मुक्त होने चाहिए।

5.3 37°C पर 2 घंटे तक इनक्यूबेट करें

उपरोक्त अभिक्रिया समाधान को मिलाएं, ट्यूब के निचले भाग में थोड़ी देर के लिए सेंट्रीफ्यूज करें, और 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। यदि ट्रांसक्रिप्ट की लंबाई 100 एनटी से कम है, तो अभिक्रिया समय को 4-8 घंटे तक बढ़ाएँ।

5.4 डीएनएसे I उपचार (वैकल्पिक)

प्रतिक्रिया पूरी हो जाने के बाद, प्रत्येक ट्यूब में 2 μL DNase I (RNase मुक्त) डालें और टेम्पलेट DNA को निकालने के लिए 37°C पर 15 मिनट तक रखें।

6. अक्सर पूछे जाने वाले प्रश्न

6.1 आईवीटी प्रतिक्रिया की उपज कम है

टेम्पलेट की गुणवत्ता का उपज से गहरा संबंध है। यदि प्रायोगिक समूह की उपज सकारात्मक नियंत्रण समूह की तुलना में काफी कम है, तो संभावित कारण हो सकते हैं।
① टेम्पलेट्स में ऐसे घटक होते हैं जो IVT प्रतिक्रिया को रोकेंगे।
② टेम्पलेट्स में कुछ गड़बड़ है.

6.2 सुझाव

① टेम्पलेट को पुनः शुद्ध करें।
② टेम्पलेट्स की एकाग्रता और अखंडता की पुष्टि करें।
③ प्रतिक्रिया समय बढ़ाएँ.
④ टेम्पलेट का इनपुट बढ़ाएँ.
⑤अन्य आरएनए पॉलीमरेज़ और संबंधित प्रमोटरों का प्रयास करें।

6.3 लघु प्रतिलेखों की उपज कम है

यदि लक्ष्य प्रतिलेख 100 nt से छोटे हैं, तो प्रतिक्रिया समय को 4-8 घंटे तक बढ़ाएँ या 20 μL प्रतिक्रिया प्रणाली में टेम्पलेट्स के इनपुट को 2ug तक बढ़ाएँ।

6.4 अप्रत्याशित रूप से लंबी प्रतिलिपियाँ हैं

यदि जेल वैद्युतकणसंचलन के परिणाम से पता चलता है कि अप्रत्याशित रूप से लंबे प्रतिलेख हैं, तो इसके संभावित कारण हो सकते हैं:
① प्लाज्मिड टेम्पलेट पूरी तरह से रैखिक नहीं हो सकते हैं।
②टेम्पलेट्स के सिरे 3' ओवरहैंग के साथ जुड़े हुए होते हैं।
③प्रतिलिपि में एक द्वितीयक संरचना होती है जो पूरी तरह से विकृत नहीं होती है।

6.5 सुझाव

①जांचें कि क्या प्लास्मिड टेम्पलेट पूरी तरह से रैखिककृत हैं। यदि आवश्यक हो, तो प्लास्मिड रैखिकीकरण फिर से करें।
②प्लास्मिड टेम्पलेट्स को रैखिक बनाने के लिए उपयुक्त प्रतिबंध एंजाइम का चयन करें और 3' ओवरहैंग के साथ संयोजी सिरों का उत्पादन करने से बचें। यदि आवश्यक हो तो कुंद अंत बनाने के लिए क्लेनो खंड या टी4 डीएनए पॉलीमरेज़ का उपयोग करना व्यावहारिक है।
③प्रतिलिपि का पता लगाने के लिए विकृत जेल का उपयोग करें।

6.6 अप्रत्याशित रूप से छोटी प्रतिलिपियाँ हैं

यदि जेल वैद्युतकणसंचलन के परिणाम से पता चलता है कि अप्रत्याशित रूप से छोटी प्रतिलिपियाँ हैं, तो इसके संभावित कारण हो सकते हैं:
①टेम्पलेट्स में T7 RNA पोलीमरेज़ के समापन अनुक्रम के अनुरूप एक अनुक्रम होता है।
②टेम्पलेट्स की GC सामग्री उच्च है.

6.7 सुझाव

①प्रतिक्रिया तापमान घटाएँ (जैसे 30℃) लेकिन ध्यान रखें कि कभी-कभी प्रतिक्रिया तापमान घटाने से उपज कम हो जाती है।
②आईवीटी प्रतिक्रिया को उत्प्रेरित करने के लिए अन्य आरएनए पॉलीमरेज़ का प्रयास करें।
③यदि टेम्पलेट्स की GC सामग्री उच्च है, तो IVT प्रतिक्रिया तापमान को 42℃ पर सेट करें या उपज और प्रतिलेखों की लंबाई बढ़ाने के लिए IVT प्रतिक्रिया प्रणाली में SSB जोड़ें।

6.8 जेल वैद्युतकणसंचलन के दौरान प्रतिलेखों का धुंधलापन होता है

यदि जेल वैद्युतकणसंचलन के दौरान प्रतिलेखों में धुंधलापन आ जाता है, तो इसके संभावित कारण निम्न हो सकते हैं:
① प्रयोगात्मक संचालन के दौरान RNase संदूषण है।
②डीएनए टेम्पलेट्स आरएनएज़ द्वारा दूषित होते हैं।

6.9 सुझाव

①सुनिश्चित करें कि सभी अभिकर्मक RNase-मुक्त H2O के साथ तैयार किए गए हैं। प्रयोगात्मक संचालन के दौरान RNase-मुक्त पिपेट टिप्स और एप्पेनडॉर्फ ट्यूब का उपयोग करें और डिस्पोजेबल लेटेक्स दस्ताने और मास्क पहनें।
②डीएनए टेम्पलेट्स को पुनः शुद्ध करें।

7. ऑर्डरिंग जानकारी

येसेन द्वारा प्रस्तुत प्रतिनिधि उत्पाद निम्नलिखित हैं। अतिरिक्त आकार उपलब्ध हैं। हमारे उत्पाद बेहतरीन प्रदर्शन और पुनरुत्पादन सुनिश्चित करने में मदद करने के लिए मिलकर काम करने के लिए अत्यधिक अनुकूलित हैं।
हम कस्टमाइज़्ड सेवाएँ भी प्रदान कर सकते हैं। यदि आप किसी ऐसे उत्पाद में रुचि रखते हैं जो दिखाया नहीं गया है, तो हमसे संपर्क करें और हम आपकी ज़रूरतों को पूरा करने के लिए आपके साथ मिलकर काम करेंगे।

तालिका 2.उत्पाद की जानकारी

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