यह लेख कॉनकैनावेलिन ए के अनुप्रयोग और चुंबकीय मोतियों के साथ इसके सहसंयोजक युग्मन का वर्णन करता है।
भाग ---- पहला। कॉनकैनावेलिन ए
कॉनकैनावैलिन ए-कोटेड मैग्नेटिक बीड्स (कॉनए बीड्स), जैसा कि नाम से पता चलता है, बायोमैग्नेटिक बीड्स हैं जिनमें प्लांट लेक्टिन कॉनकैनावैलिन ए (कॉनए) को सुपरपैरामैग्नेटिक नैनोमटेरियल के साथ जोड़ा जाता है। कॉनए मैग्नेटिक बीड्स का संक्षिप्त परिचय नीचे दिया गया है।
कॉनकैनावेलिन ए (कॉनए), एक पादप लेक्टिन प्रोटीन है, जिसमें रक्त समूह की कोई विशिष्टता नहीं होती है। यह 1936 के बाद से कटल बीन (कैनावेलिया एन्सिफोर्मिस, पेनिसेटम मैरिटिमम) से पृथक किया जाने वाला, शुद्ध किया जाने वाला और क्रिस्टलीकृत किया जाने वाला पहला पादप लेक्टिन प्रोटीन था।
ConA के 2 मुख्य रूप हैं जो उस घोल के pH पर निर्भर करते हैं जिसमें यह मौजूद है: α-2 होमोडीमर या α-4 होमोटेट्रामर [2]क्षारीय परिस्थितियों में (pH>7.0) यह एक टेट्रामर (चार आणविक भार 26 kDa सबयूनिट्स से मिलकर) के रूप में मौजूद होता है; अम्लीय परिस्थितियों में (pH 4.5-5.5) Con A एक सक्रिय द्विगुणित संरचना (52 kDa) में विघटित हो जाता है। इसके अलावा, ConA का कार्य द्विसंयोजी धनायनों से प्रभावित होता है, उदाहरण के लिए, धातु आयनों (Ca) की अनुपस्थिति में2+ और एमएन2+), इसकी संरचना और ग्लाइकोप्रोटीन बंधन कार्य को महसूस नहीं किया जा सकता है[1].
चित्र (1). (ए) कॉनए मोनोमर, (बी) कॉनए डिमर, (सी) कॉनए टेट्रामर का मैनोज़, ग्लूकोज़ और धातु आयनों के साथ आणविक मॉडलिंग।
भाग 2. मोती
बायोमैग्नेटिक बीड्स नैनोमीटर कण आकार वाले चुंबकीय माइक्रोस्फीयर का एक वर्ग है, जो पॉलिमर और अकार्बनिक चुंबकीय नैनोकणों द्वारा निर्मित होता है। चुंबकीय मोतियों को उनकी संरचना के अनुसार तीन मुख्य श्रेणियों में वर्गीकृत किया जा सकता है: कोर-शेल प्रकार की संरचना, सैंडविच प्रकार की संरचना और विसरित प्रकार की संरचना। चुंबकीय सामग्रियों में शुद्ध लौह चूर्ण, कार्बोनिल लोहा, चुंबकीय अयस्क, ऑर्थोफेराइट और लौह कोबाल्ट मिश्र धातु शामिल हैं, एट अल.
चुंबकीय नैनो सामग्री, उनके विशेष प्रभावों के कारण, जैसे छोटे आकार का प्रभाव, सतह प्रभाव और क्वांटम आकार प्रभाव, आदि, Fe के आकार में3हे4 नैनोकणों का चुंबकीय क्षेत्र 30 एनएम से कम होता है, नैनोकणों के अंदर ऊष्मीय गड़बड़ी का हस्तक्षेप महत्वपूर्ण होता है, और इस समय, ये नैनोकण एक विशेष चुंबकीय गुण, यानी सुपरपैरामैग्नेटिज्म दिखाते हैं। सुपरपैरामैग्नेटिक Fe3हे4 नैनोकणों का उपयोग जैविक उद्योग में उनके उच्च गुणवत्ता वाले गुणों के कारण व्यापक रूप से किया जाता है, जैसे कि गैर-विषाक्तता, अच्छी जैव-संगतता, अद्वितीय चुंबकीय लक्ष्यीकरण गुण, और वैकल्पिक चुंबकीय क्षेत्रों में गर्मी उत्पादन में आसानी।
इसके विपरीत, जैवअणुओं के स्थिरीकरण के लिए माइक्रोस्फीयर के साथ ConA के सहसंयोजक युग्मन के निम्नलिखित लाभ हैं:
- पुनरुत्पादनशीलता के लिए सहसंयोजक युग्मन बंधन की उच्च स्थिरता;
- लक्ष्य अणु अंतःक्रियाओं के लिए माइक्रोबीड्स की सतह पर लिगैंड ConA बंधन;
- समाधान वातावरण का गतिज लक्षण वर्णन, जैविक प्रयोगात्मक हेरफेर के लिए उपयुक्त;
भाग 3. ConA चुंबकीय मोतियों का अनुप्रयोग
जैसा कि साहित्य में बताया गया है, ConA चुंबकीय मोतियों के मुख्य अनुप्रयोगों को 3 परिदृश्यों में वर्गीकृत किया गया है, जो साइटोप्लाज्मिक झिल्ली पृथक्करण, ग्लाइकोप्रोटीन संवर्धन और स्थिर सेलुलर पहलुओं का पृथक्करण कर रहे हैं।
अनुप्रयोग I: साइटोप्लाज्मिक झिल्ली पृथक्करण
द्विसंयोजी धनायनों के सक्रियण से प्रभावित ConA चुंबकीय मोतियों का उपयोग करना, ताकि यह Ca में मौजूद रहे2+ और एमजी2+ समाधान वातावरण, जिसमें टर्मिनल α-D-मैनोसिल और α-D-ग्लूकोसिल की आत्मीयता बातचीत का कार्य होता है, जिसका उपयोग प्लाज्मा झिल्ली शुद्धिकरण में किया जाता है, एक सरल और कुशल तरीका है। उदाहरण के लिए, कोशिकाओं या ऊतकों की प्लाज्मा झिल्ली पृथक्करण प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन को आगे प्राप्त करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है। ConA कोशिकाओं पर ग्लाइकोसिलेटेड प्रोटीन को बांधने में सक्षम है, और इस सिद्धांत का उपयोग उच्च शुद्धता वाले प्लाज्मा झिल्ली को प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है। मुख्य संचालन चरण हैं: बायोटिनलेटेड ConA को स्ट्रेप्टाविडिन चुंबकीय मोतियों से बांधकर चुंबकीय मोतियों पर ConA का स्थिरीकरण; 1 घंटे के लिए ConA चुंबकीय मोतियों के साथ कोशिका झिल्ली का ऊष्मायन; एक चुंबकीय रैक पर सोखना; 5 बार TBS से धोना; और एलुएंट के साथ साइटोप्लाज्मिक झिल्ली समाधान का निक्षालन[3].
चित्र 2. प्लाज्मा झिल्ली के लिए ConA चुंबकीय मोती शुद्धिकरण चरण
अनुप्रयोग II: ग्लाइकोप्रोटीन संवर्धन
कॉनए मैनोज़ और ग्लूकोज़ के लिए विशिष्ट है और α-संयुग्मित मैनोज़ को पहचानता है, जो कई सीरम और कोशिका झिल्ली ग्लाइकोप्रोटीन का "कोर ओलिगोसेकेराइड" होता है। इसलिए, इसका उपयोग प्रतिरक्षा विज्ञान में कोशिका या ऊतक लाइसेट्स या सीरम में ग्लाइकोप्रोटीन जैसे ग्लाइकोसिलेटेड अणुओं को अलग करने के लिए किया जा सकता है।
एक प्रमुख प्रक्रिया यह थी कि ConA के साथ बाइफंक्शनल लिंकर, बिस-एन-हाइड्रॉक्सीस्यूसिनमाइड लिनोलेट (DSS) के माध्यम से एमिनोसिलेनाइज्ड मैग्नेटिक नैनोपर्ल्स (MNPs) को क्रॉस-लिंक करके, ConA मैग्नेटिक बीड्स प्राप्त करने के लिए; मेथॉक्सीएथिलीन ग्लाइकॉल (MEG) का उपयोग करके मैग्नेटिक नैनोपर्ल्स के गैर-विशिष्ट बंधन को समाप्त करने के लिए, और मैग्नेटिक पृथक्करण को पूरा करने के लिए; ट्रिप्सिन के साथ पचने वाले सेलुलर झिल्ली प्रोटीन के अर्क को जोड़ने के लिए ConA मैग्नेटिक बीड्स और कैप्चर किए गए ग्लाइकोपेप्टाइड्स दोनों को इनक्यूबेट करने के लिए, और अंत में कैप्चर किए गए ग्लाइकोपेप्टाइड्स को निकालने के लिए, और वैक्यूम सुखाने को पूरा करने के लिए। ConA मैग्नेटिक बीड्स दोनों को इनक्यूबेट किया गया, ConA मैग्नेटिक बीड्स जिनमें ग्लाइकोप्रोटीन बंधे थे, उन्हें मैग्नेटिक रैक द्वारा एकत्र किया गया, गैर-ग्लाइकोपेप्टाइड्स को धोया गया, और अंत में कैप्चर किए गए ग्लाइकोपेप्टाइड्स को निकाला गया और वैक्यूम सुखाया गया। यह विधि ट्यूमर से जुड़े प्रोटीन (जैसे, EGFR) के विशिष्ट ग्लाइकोसिलेशन साइट्स का गहन विश्लेषण करने की अनुमति देती है[4].
चित्र 3. विभिन्न लेक्टिन से जुड़े सुपरपैरामैग्नेटिक नैनोकण
अनुप्रयोग III: स्थिर कोशिकाओं का अलगाव
कोना चुंबकीय मोतियों (उच्च शुद्धता वाले साथी कोनकैनावेलिन ए से सहसंयोजक रूप से बंधे चुंबकीय मोती) का उपयोग कोशिका झिल्ली या परमाणु झिल्ली पर ग्लाइकोप्रोटीन को बांधने के लिए किया जाता है, जिससे कोशिकाओं या नाभिक को कैप्चर किया जाता है, जिससे कोशिकाओं की छोटी संख्या के प्रयोगात्मक हेरफेर को देखने की अनुमति मिलती है। उदाहरण के लिए, कोना चुंबकीय मोतियों का उपयोग CUT&Tag और CUT&RUN में किया जाता है [5] प्रयोग, जो क्रोमेटिन की संरचना और कार्य का अध्ययन करने के लिए उपयोग की जाने वाली नवीन तकनीकें हैं, और संचालन को देखने तथा सेंट्रीफ्यूजेशन के कारण होने वाली कोशिका क्षति की समस्या से बचने के लिए कोशिकाओं में ConA चुंबकीय मोतियों को बांधकर उन्हें स्थिर किया जाता है।
डीएनए-प्रोटीन अंतःक्रियाओं के अध्ययन के लिए पारंपरिक ChIP-seq प्रौद्योगिकी की तुलना में, CUT&Tag और CUT&RUN के निम्नलिखित लाभ हैं:
- ConA चुंबकीय मोती कोशिका झिल्ली ग्लाइकोप्रोटीन से बंध कर ऑपरेशन को दृश्यमान बनाते हैं और प्रयोगात्मक ऑपरेशन अनुभव को बढ़ाते हैं;
- सेंट्रीफ्यूजेशन की कोई आवश्यकता नहीं है, केवल ConA चुंबकीय मोतियों को चुंबकीय रैक पर सोखकर कोशिका नमूनों और विलयनों का पृथक्करण पूरा किया जाता है;
- इसे 10 कोशिकाओं से भी कम की संख्या में संचालित किया जा सकता है, जिससे ChIP-seq के लिए बड़ी संख्या में नमूनों की आवश्यकता समाप्त हो जाती है।
चित्र 4. ChIP-seq, CUT&Tag, CUT RUN प्रयोग प्रवाह का योजनाबद्ध आरेख
भाग 4. येसेन कॉनकैनावेलिन ए-कोटेड चुंबकीय मोती
YEASEN द्वारा विकसित ConA चुंबकीय मोती, सख्त कच्चे माल के चयन और कई प्रक्रिया अनुकूलन और सुधार के बाद ग्लाइकोसिलेशन संशोधन के साथ ग्लाइकोप्रोटीन, ग्लाइकोलिपिड्स, पॉलीसेकेराइड और अन्य अणुओं को तेजी से, कुशल, संवेदनशील और विशिष्ट तरीके से बांधने में सक्षम हैं। इसका उपयोग मुख्य रूप से सेल अलगाव या सेल या ऊतक लाइसेट्स या सीरम में ग्लाइकोप्रोटीन जैसे ग्लाइकोसिलेटेड अणुओं के अलगाव के लिए किया जाता है, और विशेष रूप से CUT & RUN और CUT & Tag (ChIP-seq प्रयोगों के लिए एक अभिनव तकनीक) जैसे प्रयोगों के लिए सीधे उपयोग किया जाता है।
1.उत्पाद की विशेषताएँ
- स्थिर बैच उत्पादन और परिणामों की बेहतर पुनरुत्पादकता;
- स्थिर प्रदर्शन भंडारण
- सेल कैप्चर दक्षता> 90%
2.उत्पाद जानकारी
| बिल्ली नं. | कैट#19810ES |
| आकार | 1एमएल/5एमएल/20एमएल |
| रंग | भूरा पीला |
| मनका एकाग्रता | 10 मिलीग्राम/एमएल |
| यथार्थ सामग्री | 9-11 मिलीग्राम/एमएल |
| मनका आकार | 1 µm |
| क्षमता | 105 कोशिकाएं/µL मोती |
3.उत्पाद प्रदर्शन डेटा
(1)मोनोडिस्पर्सिटी
समान उपचार स्थितियों और 10×/40× के आवर्धन के तहत, ConA मोती मूल रूप से मोनोडिस्पर्स्ड थे, और प्रतियोगी के सापेक्ष कोई स्पष्ट समूहन नहीं देखा गया था।
| YEASEN कच्चे माल मोती | प्रतियोगी ConA मोती | YEASEN ConA मोती（Cat#19810） |
चित्र 5. मोनोडिस्पर्सिटी परिणामों का ग्राफ़
(2)ConA बीड्स बाइंडिंग सेल का प्रभाव
समान संख्या में कोशिकाओं को समान समय के लिए मोतियों के साथ संवर्धित किया गया, और ConA मोतियों के संयोजन के बाद बची हुई कोशिकाओं की संख्या स्वचालित रूप से कोशिका विश्लेषक के तहत पता लगा ली गई, और परिणामों से पता चला कि YEASEN कॉनए बीड्स (कैट#19810) ने प्रतिस्पर्धी उत्पादों से बेहतर प्रदर्शन किया।
| सेल निलंबन | प्रतिस्पर्धी ConA चुंबकीय मोतियों के बंधन के बाद बची हुई कोशिकाएँ | YEASEN के बंधन के बाद बची हुई कोशिकाएँ ConA चुंबकीय मोती |
चित्र 6.ConA चुंबकीय मनका बद्ध कोशिकाओं का चित्र
(3)सेल बाइंडिंग संख्या और पुनरावृत्ति
दोनों 10µL YEASEN कॉनए बीड्स (कैट#19810) और 10µL प्रतियोगी कॉनए बीड्स, प्रतिस्पर्धी के बराबर E7 स्तर की कोशिकाओं को बांधते हैं। बार-बार संचालन के तहत सेल कैप्चर >90% था।
चित्र 7. परिणाम ConA मोती बंधन सेल संख्या और कब्जा दर
(4)त्वरण स्थिरता
1 एमएल/ट्यूब पर वितरित करें। भंडारण की स्थिति थी: 2, 4, 7, 11 और 14 दिनों के लिए 4℃, 37℃ त्वरित उपचार, और 1, 3, 6 और 8 दिनों के लिए -20℃ विनाश उपचार। परिणामों से पता चला कि समान प्रायोगिक स्थितियों के तहत: 4℃ पर संग्रहीत उत्पादों की सेल कैप्चर दर, 37℃ पर त्वरित उपचार और -20℃ पर विनाश उपचार >95% था, और प्रत्येक उपचार की स्थिति के तहत प्रतिकृति के तीन समूहों का CV मान 1% के भीतर था, जिसने अच्छी प्रजनन क्षमता दिखाई।
चित्र 8. परिणाम विभिन्न तापमान और समय के तहत ConA मोतियों की सेल कैप्चर दर और पुनरावृत्ति पूर्वाग्रह
आदेश की जानकारी
| 19810ईएस |