विवरण
HEK293 होस्ट सेल अवशिष्ट डीएनए टुकड़ा विश्लेषण किट के लिए डिज़ाइन किया गया है मध्यवर्ती, अर्ध-तैयार उत्पादों और जैविक तैयारियों के अंतिम उत्पादों में विभिन्न लंबाई के HEK293 अवशिष्ट डीएनए टुकड़ों का मात्रात्मक विश्लेषण। यह किट qPCR प्रतिदीप्ति जांच सिद्धांत का उपयोग करके 200 बेस पेयर से नीचे और ऊपर दोनों ही HEK293 डीएनए अवशेषों का विशेष रूप से और तेज़ी से पता लगाती है, जिसकी मात्रा सीमा 10 fg/μL जितनी कम है। इसमें HEK293 डीएनए नियंत्रण (डीएनए मात्रात्मक संदर्भ) भी शामिल है। इस किट का उपयोग कंपनी के चुंबकीय मनका-आधारित अवशिष्ट डीएनए नमूना तैयारी किट के साथ किया जा सकता है (कैट#18461ES/18462ईएस).
उत्पाद की जानकारी
| एसकेयू | 41316ES70 / 41316ES74 |
| आकार | 4×50 टी / 4×100 टी |
अवयव
| घटक सं. | नाम | 41316ES70 | 41316ES74 |
| 41316-ए | HEK293 qPCR मिक्स | 0.75 एमएल×4 नलीएस | 1.5 एमएल×4 नलीएस |
| 41316-बी1 | HEK293 प्राइमर और जांच मिश्रण -82 | 250 μएल×1 नली | 500 μएल×1 नली |
| 41316-बी2 | HEK293 प्राइमर और जांच मिश्रण-133 | 250 μएल×1 नली | 500 μएल×1 नली |
| 41316-बी3 | HEK293 प्राइमर और जांच मिश्रण -227 | 250 μएल×1 नली | 500 μएल×1 नली |
| 41316-बी4 | HEK293 प्राइमर और जांच मिश्रण -515 | 250 μएल×1 नली | 500 μएल×1 नली |
| 41316-सी | डीएनए कमजोरीकरण बफर | 1.8 एमएल×2 नलीएस | 1.8 एमएल×4 नलीएस |
| 41316-डी | HEK293 डीएनए नियंत्रण（30 एनजी/μL） | 25 μएल×1 नली | 50 μएल×1 नली |
भंडारण और शिपिंग:
1. सभी घटकों को सूखी बर्फ पर भेजा जाता है और प्राप्ति के बाद उन्हें -25°C से -15°C पर संग्रहित किया जाना चाहिए। शेल्फ लाइफ 2 साल है। घटक A और B1, B2, B3, और B4 को प्रकाश से सुरक्षित रखा जाना चाहिए।
2. प्राप्ति के बाद, सत्यापित करें कि सभी 7 घटक मौजूद हैं और उन्हें तुरंत अनुशंसित तापमान पर संग्रहीत करें।
सावधानियां:
1. यह उत्पाद केवल शोध के उद्देश्य के लिए है।
2. सुरक्षा और स्वास्थ्य कारणों से, कृपया ऑपरेशन के दौरान प्रयोगशाला कोट और डिस्पोजेबल दस्ताने पहनें।
3. इस अभिकर्मक का उपयोग करने से पहले, निर्देश पुस्तिका को ध्यान से पढ़ें। प्रयोग मानक प्रक्रियाओं का पालन करते हुए किए जाने चाहिए, जिसमें नमूना संभालना, प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करना और पाइपिंग शामिल है।
4. प्रत्येक घटक को हल्के से हिलाकर अच्छी तरह मिश्रित किया जाना चाहिए तथा उपयोग से पहले थोड़ी देर के लिए सेंट्रीफ्यूज किया जाना चाहिए।
संगत उपकरण:
इसमें निम्नलिखित उपकरण शामिल हैं, परंतु इन्हीं तक सीमित नहीं हैं: थर्मो साइंटिफिक: एबीआई 7500, एबीआई क्वांट स्टूडियो 5, एबीआई स्टेप वनप्लस, बायो-रेड: CFX96 ऑप्टिक मॉड्यूल, शंघाई होंग्शी मेडिकल टेक्नोलॉजी: SLAN-96S
उपयोग हेतु निर्देश
1. HEK293 डीएनए नियंत्रण मात्रात्मक संदर्भ का कमजोरीकरण और मानक वक्रों की तैयारी
HEK293 फ़्रैगमेंट एनालिसिस किट में अलग-अलग लंबाई के चार प्रवर्धन टुकड़े शामिल हैं: 82 bp, 133 bp, 227 bp, और 515 bp। मानक वक्र स्थापित करते समय, प्रत्येक प्रवर्धन टुकड़े के लिए अलग-अलग वक्र सेट करें और संबंधित मानक वक्रों के आधार पर उनकी अवशिष्ट मात्रा और सापेक्ष वितरण की गणना करें।
HEK293 DNA कंट्रोल क्वांटिटेटिव रेफरेंस का ग्रेडिएंट डाइल्यूशन करने के लिए किट में दिए गए DNA डाइल्यूशन बफर का इस्तेमाल करें। डाइल्यूशन सांद्रता होनी चाहिए: 3 ng/μL, 300 pg/μL, 30 pg/μL, 3 pg/μL, 300 fg/μL, और 30 fg/μL.
विवरण निम्नानुसार है
1)किट से HEK293 DNA कंट्रोल और DNA डाइल्यूशन बफर को पिघलने के लिए बर्फ पर रखें। पूरी तरह पिघलने के बाद, मिश्रण करने के लिए धीरे से भंवर बनाएं और ट्यूब के निचले हिस्से में घोल इकट्ठा करने के लिए थोड़ी देर (10 सेकंड) सेंट्रीफ्यूज करें।
2)छह साफ 1.5 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब तैयार करें और उन्हें Std0, Std1, Std2, Std3, Std4, और Std5 के रूप में लेबल करें।
3). Std0 लेबल वाली ट्यूब में, 3 ng/μL की सांद्रता प्राप्त करने के लिए 90 μL DNA Dilution Buffer और 10 μL HEK293 DNA Control डालें। मिश्रण करने के लिए धीरे से घुमाएँ और थोड़े समय के लिए (10 सेकंड) सेंट्रीफ्यूज करें। इस सांद्रता को अलग करके -20°C पर अल्पकालिक उपयोग (3 महीने तक) के लिए संग्रहीत किया जा सकता है। बार-बार फ्रीज-थॉ चक्र से बचें।
4). Std0, Std1, Std2, Std3, Std4, और Std5 लेबल वाली ट्यूबों में, सबसे पहले प्रत्येक में 90 μL DNA Dilution Buffer डालें। प्रत्येक कमजोरीकरण चरण को धीरे से मिलाया जाना चाहिए और एकरूपता सुनिश्चित करने के लिए थोड़ी देर के लिए सेंट्रीफ्यूज किया जाना चाहिए। फिर ग्रेडिएंट निष्पादित करें निम्न प्रकार से पतला करें:
| टीउबे | पतला करने की क्रिया | अंतिम एकाग्रता |
| मानक1 | 10 μL Std0 + 90 μL डीएनए कमजोरीकरण बफर | 300 पीजी/μएल |
| मानक2 | 10 μएल स्टैंडर्ड1 + 90 μL डीएनए कमजोरीकरण बफर | 30 पीजी/μएल |
| मानक3 | 10 μएल स्टैंडर्ड2 + 90 μL डीएनए कमजोरीकरण बफर | 3 पीजी/μL |
| मानक4 | 10 μL Std3 + 90 μL डीएनए कमजोरीकरण बफर | 300 एफजी/μएल |
| मानक5 | 10 μएल स्टैंडर्ड4 + 90 μL डीएनए कमजोरीकरण बफर | 30 एफजी/μएल |
तालिका 1: मानक ग्रेडिएंट कमजोरीकरण
* प्रत्येक सांद्रता के लिए, 3 प्रतिकृतियाँ करें। यह अभिकर्मक 300 pg/μL से 30 fg/μL की रैखिक सीमा के भीतर परीक्षण कर सकता है। यदि आवश्यक हो, तो रैखिक सीमा को उचित रूप से बढ़ाया या संकुचित किया जा सकता है।
** बार-बार होने वाले फ्रीज-थॉ चक्रों को कम करने और संदूषण से बचने के लिए, डीएनए क्वांटिफिकेशन को अलग करने और संग्रहीत करने की सिफारिश की जाती है एसपहले प्रयोग के लिए -20°C पर मानकीकृत करें।
*** अप्रयुक्त, पिघले हुए डीएनए तनुकरण को 2-8°C पर 7 दिनों तक संग्रहीत किया जा सकता है। यदि लंबे समय तक उपयोग नहीं किया जाता है, तो इसे -20°C पर संग्रहीत करें।
**** टेम्पलेट का पूर्ण मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए, प्रत्येक ग्रेडिएंट तनुकरण को लगभग 1 मिनट तक धीरे से हिलाएं।
2. परीक्षण नमूना (टीएस) की तैयारी
प्रयोग सेटअप के अनुसार परीक्षण नमूना TS तैयार करें, इस प्रकार:
1) 100 μL परीक्षण नमूना लें और इसे 1.5 mL साफ सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में डालें। इसे TS के रूप में लेबल करें, नमूना पूर्व-उपचार करें, और t तैयार करेंहे शुद्धय द परीक्षण नमूना.
2) एक साथ चार अलग-अलग विस्तार लंबाई का विश्लेषण करने की आवश्यकता को पूरा करने के लिए, पूर्व-उपचारित परीक्षण नमूने की मात्रा ≥120 μL होनी चाहिए। इसलिए, पूर्व-उपचार के लिए प्रत्येक नमूने की 2 ट्यूब तैयार करने और निष्कर्षण के बाद, उपयोग के लिए उन्हें एक साथ मिलाने की सिफारिश की जाती है।
3. नेगेटिव एक्सट्रैक्शन कंट्रोल (एनसीएस) की तैयारी
प्रयोग सेटअप के अनुसार नकारात्मक निष्कर्षण नियंत्रण एनसीएस तैयार करें, इस प्रकार:
1) नमूना मैट्रिक्स समाधान (या डीएनए कमजोरीकरण) के 100 μL लें बफर) को 1.5 एमएल साफ सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में डालें। इसे NCS के रूप में लेबल करें।
2) परीक्षण नमूनों के बैच के साथ नकारात्मक नियंत्रण एनसीएस का नमूना पूर्व-उपचार करें और शुद्ध नकारात्मक नियंत्रण एनसीएस समाधान तैयार करें।
3) एक साथ चार अलग-अलग एक्सटेंशन लंबाई का विश्लेषण करने की आवश्यकता को पूरा करने के लिए, पूर्व-उपचारित NCS नमूने की मात्रा ≥120 μL होनी चाहिए। इसलिए, पूर्व-उपचार के लिए प्रत्येक NCS नमूने की 2 ट्यूब तैयार करने और निष्कर्षण के बाद, उपयोग के लिए उन्हें एक साथ मिलाने की सिफारिश की जाती है।
4. नो टेम्पलेट कंट्रोल (एनटीसी) की तैयारी
प्रयोग सेटअप के अनुसार नो टेम्पलेट नियंत्रण एनटीसी तैयार करें, इस प्रकार:
1) कोई टेम्पलेट नियंत्रण (एनटीसी) नमूना की आवश्यकता नहीं है पूर्व उपचार, और इसे qPCR का उपयोग करके अवशिष्ट डीएनए सामग्री का पता लगाने के चरण से शुरू करके तैयार किया जा सकता है।
2) प्रत्येक ट्यूब या वेल के लिए, NTC नमूने में 20 μL मिश्रण (यानी, 15 μL HEK293 qPCR मिक्स + 5 μL संबंधित HEK293 प्राइमर और जांच मिक्स) + 10 μL DNA कमजोर पड़ने वाला बफर होता है। 3 प्रतिकृति कुओं के लिए पर्याप्त मात्रा में तैयार करने की सिफारिश की जाती है।
5. qPCR प्रतिक्रिया प्रणाली
| 82 बीपी | आयतन (μएल) |
| HEK293 qPCR मिक्स* | 15 |
| HEK293 प्राइमर और जांच मिश्रण -82 | 5 |
| डीएनए टेम्पलेट** | 10 |
| कुल मात्रा*** | 30 |
मेज़ 2. प्रतिक्रिया प्रणाली के लिए 82 बीपी टुकड़ा
| 133 बी.पी. | आयतन (μएल) |
| HEK293 qPCR मिक्स* | 15 |
| HEK293 प्राइमर और जांच मिश्रण-133 | 5 |
| डीएनए टेम्पलेट** | 10 |
| कुल मात्रा*** | 30 |
मेज़ 3. प्रतिक्रिया प्रणाली 133 के लिए बीपी टुकड़ा
| 227 बी.पी. | आयतन (μएल) |
| HEK293 qPCR मिक्स* | 15 |
| HEK293 प्राइमर और जांच मिश्रण -227 | 5 |
| डीएनए टेम्पलेट** | 10 |
| कुल मात्रा*** | 30 |
मेज़ 4. प्रतिक्रिया प्रणाली 2 के लिए27 बीपी टुकड़ा
| 515 बी.पी. | आयतन (μएल) |
| HEK293 qPCR मिक्स* | 15 |
| HEK293 प्राइमर और जांच मिश्रण -515 | 5 |
| डीएनए टेम्पलेट** | 10 |
| कुल मात्रा*** | 30 |
मेज़ 5. प्रतिक्रिया प्रणाली 515 के लिए बीपी टुकड़ा
* कुओं की संख्या के आधार पर इस प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक मिश्रण की कुल मात्रा की गणना करने के लिए:
मिश्रण = (प्रतिक्रिया कुओं की संख्या + 2) × (15 + 5) μL (2 कुओं के नुकसान को ध्यान में रखते हुए)। आमतौर पर, प्रत्येक नमूने के लिए 3 प्रतिकृति कुएँ तैयार की जाती हैं।
** प्रतिक्रिया कुओं की संख्या = (5 सांद्रता ढाल मानक वक्र कुएँ + 1 कोई टेम्पलेट नियंत्रण (एनटीसी) नहीं + 1 नकारात्मक नियंत्रण समाधान (एनसीएस) + एन परीक्षण नमूने (टीएस)) × 3.
एनटीसी (नो टेम्पलेट कंट्रोल): डीएनए डाइल्यूशन बफर
एनसीएस (नकारात्मक नियंत्रण समाधान): नमूना तैयारी के बाद नमूना मैट्रिक्स समाधान या डीएनए कमजोर पड़ने बफर-इलाज शुद्ध समाधान प्राप्त करने के लिए, जिसे एनसीएस कहा जाता है।
टीएस (परीक्षण नमूना): परीक्षण किया जाने वाला नमूना।
***नमूने निकालने और ट्यूबों को सील करने के बाद, ट्यूब की दीवारों से नीचे तक तरल इकट्ठा करने के लिए कम गति (10 सेकंड) पर थोड़ी देर के लिए सेंट्रीफ्यूज करें। फिर अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए कम से कम 5 सेकंड के लिए भंवर करें। उसके बाद, एक और कम गति सेंट्रीफ्यूजेशन (10 सेकंड) करें। यदि कोई बुलबुले हैं, तो उन्हें निकालना सुनिश्चित करें।
|
| 82 बीपी | 133 बीपी | 227 बीपी | 515 बीपी | ||||||||
|
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| ए | कक्षा1 | कक्षा1 | कक्षा1 | कक्षा1 | कक्षा1 | कक्षा1 | कक्षा1 | कक्षा1 | कक्षा1 | कक्षा1 | कक्षा1 | कक्षा1 |
| बी | कक्षा2 | कक्षा2 | कक्षा2 | कक्षा2 | कक्षा2 | कक्षा2 | कक्षा2 | कक्षा2 | कक्षा2 | कक्षा2 | कक्षा2 | कक्षा2 |
| सी | कक्षा3 | कक्षा3 | कक्षा3 | कक्षा3 | कक्षा3 | कक्षा3 | कक्षा3 | कक्षा3 | कक्षा3 | कक्षा3 | कक्षा3 | कक्षा3 |
| डी | कक्षा4 | कक्षा4 | कक्षा4 | कक्षा4 | कक्षा4 | कक्षा4 | कक्षा4 | कक्षा4 | कक्षा4 | कक्षा4 | कक्षा4 | कक्षा4 |
| इ | कक्षा5 | कक्षा5 | कक्षा5 | कक्षा5 | कक्षा5 | कक्षा5 | कक्षा5 | कक्षा5 | कक्षा5 | कक्षा5 | कक्षा5 | कक्षा5 |
| एफ | टी | टी | टी | टी | टी | टी | टी | टी | टी | टी | टी | टी |
| जी | एनसीएस | एनसीएस | एनसीएस | एनसीएस | एनसीएस | एनसीएस | एनसीएस | एनसीएस | एनसीएस | एनसीएस | एनसीएस | एनसीएस |
| एच | एनटीसी | एनटीसी | एनटीसी | एनटीसी | एनटीसी | एनटीसी | एनटीसी | एनटीसी | एनटीसी | एनटीसी | एनटीसी | एनटीसी |
तालिका 6: संदर्भ प्लेट लेआउट
यह उदाहरण दिखाओयह अवशिष्ट HEK293 डीएनए के प्रवर्धन टुकड़ों का विश्लेषण करने के लिए qPCR पहचान प्रक्रिया है।परीक्षण नमूनों में शामिल हैं: HEK293 DNA मानक वक्र के 5 सांद्रता ढाल, 1 परीक्षण नमूना (TS), 1 नकारात्मक नियंत्रण समाधान (NCS), और 1 नो-टेम्पलेट नियंत्रण (NTC)। प्रत्येक नमूने के लिए 3 प्रतिकृति कुओं को चलाने की सिफारिश की जाती है।
6. प्रवर्धन कार्यक्रम पैरामीटर (टीह्री-चरण विधि) (ABI 7500 qPCR उपकरण, सॉफ्टवेयर संस्करण 2.0 का उपयोग करके उदाहरण)**
1) एक नया रिक्त प्रोग्राम बनाएं और पहचान टेम्पलेट के रूप में "निरपेक्ष परिमाणीकरण" का चयन करें।
2) चार अलग-अलग प्रवर्धन खंड लंबाई के लिए, नए डिटेक्शन जांच बनाएं, उन्हें "HEK293-82", "HEK293-133", "HEK293-227", और "HEK293-515" नाम दें। रिपोर्टर फ्लोरोफोर को "FAM" और क्वेंचर फ्लोरोफोर को "कोई नहीं" के रूप में चुनें। डिटेक्शन के लिए संदर्भ डाई को "ROX" के रूप में सेट करें (इंस्ट्रूमेंट मॉडल और अन्य कारकों के आधार पर संदर्भ डाई को जोड़ा या नहीं जोड़ा जा सकता है)।
3) "चयनित कुओं को लक्ष्य(लक्ष्य) असाइन करें" पैनल में, मानक वक्र कुओं के लिए "कार्य" फ़ील्ड को "मानक" के रूप में सेट करें, और "मात्रा" फ़ील्ड में संबंधित मानों को "300000", "30000", "3000", "300", "30" (प्रति कुएँ DNA सांद्रता को दर्शाता है, fg/μL में) के रूप में असाइन करें। "नमूना नाम" फ़ील्ड में कुओं का नाम "300 pg/μL", "30 pg/μL", "3 pg/μL", "300 fg/μL", "30 fg/μL" रखें। NTC कुओं के लिए, "कार्य" को "NTC" पर सेट करें। NCS और TS कुओं के लिए, "कार्य" को "अज्ञात" पर सेट करें, और "नमूना नाम" फ़ील्ड में कुओं का नाम "NCS" और "TS" रखें। इन मापदंडों को सेट करने के बाद, उपकरण चलाना शुरू करने के लिए "रन शुरू करें" पर क्लिक करें।
4) प्रवर्धन कार्यक्रम सेटिंग्स: 30 μL की प्रतिक्रिया मात्रा के साथ तीन-चरण प्रवर्धन कार्यक्रम सेट करें।
| कदम | अस्थायी (℃) | समय | साइकिल |
| संदूषक पाचन
| 37℃ | 5 मिनट | 1 |
| पूर्व विकृतीकरण
| 95℃ | 5 मिनट | 1 |
| विकृतीकरण
| 95℃ | 15 सेकंड |
45 |
| एनीलिंग
| 60℃ | 30 सेकंड | |
| विस्तार (प्रतिदीप्ति एकत्रित करें) | 72℃ | 30 सेकंड |
मेज़7. पीसीआर प्रक्रिया
7. qPCR परिणाम विश्लेषण
1) "एम्पलीफिकेशन प्लॉट" के अंतर्गत "विश्लेषण" पैनल में, सिस्टम स्वचालित रूप से "थ्रेशोल्ड" सेट कर देगा। कभी-कभी, डिफ़ॉल्ट "थ्रेशोल्ड" बेसलाइन के बहुत करीब होता है, जिससे प्रतिकृतियों के बीच महत्वपूर्ण सीटी भिन्नता होती है। आप "थ्रेशोल्ड" को मैन्युअल रूप से उचित स्थिति में समायोजित कर सकते हैं और "विश्लेषण करें" पर क्लिक कर सकते हैं। इस बिंदु पर, आप प्रारंभिक रूप से "मल्टीकंपोनेंट प्लॉट" में प्रवर्धन वक्रों की जांच कर सकते हैं कि वे सामान्य हैं या नहीं।
2) "मानक वक्र" के अंतर्गत "विश्लेषण" पैनल में, आप मानक वक्र के R², प्रवर्धन दक्षता (Eff%), ढलान और अवरोधन को पढ़ सकते हैं। एक सामान्य मानक वक्र के लिए: R² > 0.99, प्रवर्धन दक्षता (90% ≤ Eff% ≤ 110%), और ढलान -3.6 और -3.1 के बीच।
3) "व्यू वेल टेबल" के अंतर्गत "विश्लेषण" पैनल में, आप नो-टेम्पलेट कंट्रोल (NTC), नेगेटिव कंट्रोल (NCS) और टेस्ट सैंपल (TS) के लिए "मात्रा" कॉलम पढ़ सकते हैं, जिसमें इकाई fg/μL में है। इकाइयों को बाद में रिपोर्ट में परिवर्तित किया जा सकता है।
4) परिणाम विश्लेषण के लिए पैरामीटर सेटिंग विशिष्ट उपकरण मॉडल और सॉफ़्टवेयर संस्करण पर निर्भर होनी चाहिए। आमतौर पर, उपकरण स्वचालित रूप से परिणामों की व्याख्या कर सकता है।
5) नकारात्मक नियंत्रण (एनसीएस) का सीटी मान मानक वक्र की न्यूनतम सांद्रता के औसत सीटी मान से अधिक होना चाहिए।
6) नो-टेम्प्लेट नियंत्रण (NTC) का परिणाम "अनिर्धारित" होना चाहिए या इसका Ct मान ≥ 32 होना चाहिए।
दस्तावेज़
भुगतान और सुरक्षा
आपकी भुगतान जानकारी सुरक्षित रूप से संसाधित की जाती है। हम क्रेडिट कार्ड के विवरण को संग्रहीत नहीं करते हैं और न ही आपके क्रेडिट कार्ड की जानकारी तक पहुंच है।
जाँच करना
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उपवास
यह उत्पाद केवल शोध उद्देश्यों के लिए है और मनुष्यों या जानवरों में चिकित्सीय या नैदानिक उपयोग के लिए अभिप्रेत नहीं है। उत्पाद और सामग्री येसेन बायोटेक्नोलॉजी के स्वामित्व वाले पेटेंट, ट्रेडमार्क और कॉपीराइट द्वारा संरक्षित हैं। ट्रेडमार्क प्रतीक मूल देश को इंगित करते हैं, जरूरी नहीं कि सभी क्षेत्रों में पंजीकरण हो।
कुछ अनुप्रयोगों के लिए अतिरिक्त तृतीय-पक्ष बौद्धिक संपदा अधिकारों की आवश्यकता हो सकती है।
येसेन नैतिक विज्ञान के प्रति समर्पित हैं, उनका मानना है कि हमारे शोध में सुरक्षा और नैतिक मानकों को सुनिश्चित करते हुए महत्वपूर्ण प्रश्नों का समाधान किया जाना चाहिए।