Dalam beberapa tahun terakhir, dengan pesatnya perkembangan biomedis, munculnya terapi sel dan gen di bawah pandemi COVID-19, dan munculnya vaksin mRNA, memastikan keamanan dan keandalan produk biologis telah menjadi titik fokus bagi pemerintah dan badan pengatur di seluruh dunia. Kontaminasi mikoplasma merupakan jenis kontaminasi yang umum tetapi biasanya sulit dihilangkan. Persyaratan peraturan mengamanatkan "memastikan tidak adanya kontaminasi mikoplasma" untuk bioproses yang melibatkan kultur sel.
Persyaratan Badan Pengatur untuk Pengujian Mikoplasma:
- "Panduan untuk Industri: Karakterisasi dan Kualifikasi Substrat Sel dan Bahan Biologis Lainnya yang Digunakan dalam Produksi Vaksin Virus untuk Indikasi Penyakit Menular" dari FDA menetapkan pengendalian mikoplasma untuk bahan mentah, benih virus, dan cairan panen yang belum diproses.
- Edisi 2020 dari Farmakope Tiongkok Bagian III "Persiapan dan Kontrol Kualitas Substrat Sel Hewan yang Digunakan untuk Pengujian Produksi Produk Biologis" memerlukan pengujian mikoplasma untuk sel produksi, termasuk Bank Sel Induk (MCB), Bank Sel Kerja (WCB), dan Sel Akhir Produksi (EOPC).
- "Pedoman Teknis untuk Penelitian Farmasi dan Evaluasi Produk Terapi Sel Imun (Uji Coba)" merekomendasikan pelaksanaan pengujian terkait keamanan mikoplasma pada sampel perantara yang sesuai pada titik waktu utama atau penerapan langkah-langkah yang relevan untuk pengendalian. Pengujian mikoplasma juga diperlukan sebagai uji pelepasan untuk produk akhir.
Pengujian Asam Nukleat (NAT) dan Metode Tradisional:
Sebelum munculnya metode deteksi cepat seperti Nucleic Acid Amplification Technology (NAT), metode kultur tradisional dan uji sel indikator digunakan. Namun, karena siklus deteksi yang panjang atau masalah sensitivitas, metode ini sering memperpanjang siklus produksi atau pelepasan atau memerlukan pelepasan bahan sel bersyarat berdasarkan penilaian risiko atau eksplorasi metode alternatif. Dengan kemajuan terapi sel dan gen, ada peningkatan permintaan dalam industri untuk metode deteksi mikoplasma dengan ketepatan waktu dan sensitivitas yang lebih tinggi. Masa simpan produk yang pendek tidak dapat mendukung periode pengujian yang panjang, sehingga metode NAT muncul sebagai alternatif yang lebih baik.
Saat ini, Farmakope Eropa (EP) <2.6.7>, Farmakope Jepang (JP), dan Farmakope Amerika Serikat (USP) <63> semuanya telah memasukkan metode NAT sebagai metode deteksi mikoplasma. Akan tetapi, validasi metode ini dan perbandingan dengan metode tradisional untuk memastikan sensitivitasnya tidak lebih rendah merupakan prasyarat untuk penggunaannya. Meskipun Farmakope Tiongkok (ChP) edisi 2020 belum memasukkan NAT sebagai metode deteksi mikoplasma, ia menyebutkan kemungkinan menggunakan "metode lain yang diakui oleh otoritas pengawas obat nasional." Pada bulan Mei 2022, Pusat Peninjauan Obat dari Badan Pengawas Produk Medis Nasional (NMPA) merilis "Pedoman Teknis untuk Penelitian dan Evaluasi Farmasi Produk Terapi Sel Imun (Uji Coba)," yang menyarankan untuk mempertimbangkan pengembangan metode deteksi steril dan mikoplasma baru untuk pengujian pelepasan dalam keadaan khusus ketika volume sampel terbatas atau pelepasan cepat diperlukan dan metode farmakope tidak memadai. Oleh karena itu, metode NAT diharapkan semakin banyak digunakan oleh pemasok bahan baku dan perusahaan Produk Obat Terapi Lanjutan (ATMP) sebagai metode yang mampu mendukung pengujian pelepasan mikoplasma secara cepat.
Metode NAT - Persyaratan Validasi Metode
Proses validasi untuk metode NAT dijelaskan secara rinci dalam Farmakope Eropa <2.6.7> dan Farmakope Jepang, dengan konten yang pada dasarnya konsisten. National Institutes for Food and Drug Control (NIFDC) juga telah menerbitkan sebuah artikel berjudul "Pertimbangan tentang Metode Deteksi Asam Nukleat dan Validasi Metodologi untuk Pemeriksaan Mikoplasma," yang bertujuan untuk memberikan panduan bagi pengembang dan pengguna metode amplifikasi asam nukleat mikoplasma di Tiongkok. Spesifisitas, Batas Deteksi, dan Ketahanan sangat penting untuk memvalidasi metode NAT mikoplasma. Jika kit komersial digunakan untuk deteksi mikoplasma, validasi kesesuaian metode dapat dilakukan berdasarkan laporan kinerja kit komprehensif pemasok, dikombinasikan dengan lingkungan laboratorium dan jenis sampel.
Kekhususan:
Spesifisitas mengacu pada kemampuan metode analisis untuk menentukan analit secara akurat dengan adanya komponen lain (seperti pengotor, produk degradasi, eksipien, dll.). EP menekankan perlunya fokus pada reaksi silang antara spesies bakteri lain yang terkait erat dengan pohon filogenetik, seperti Clostridium, Lactobacillus, dan Streptococcus dalam bakteri Gram-positif. Perhatian juga harus diberikan pada jenis kontaminan umum seperti kontaminasi DNA manusia dalam sel inang dan lingkungan eksperimen.
Batas Deteksi:
Batas deteksi adalah jumlah analit terendah yang dapat dideteksi dalam sampel. Ini berfungsi sebagai dasar identifikasi kualitatif dan tidak perlu dikuantifikasi sebagai nilai yang tepat. EP memerlukan 24 titik data deteksi untuk setiap spesies mikoplasma pada setiap konsentrasi pengenceran. Ini dapat dicapai dengan melakukan tiga pengenceran serial 10 kali lipat independen pada hari yang berbeda, dengan delapan deteksi berulang untuk setiap gradien pengenceran, atau dengan melakukan empat pengenceran serial 10 kali lipat independen pada hari yang berbeda, dengan enam deteksi berulang untuk setiap gradien pengenceran. Tingkat positif deteksi lebih dari 95% dapat dianggap sebagai batas deteksi. Untuk jenis mikoplasma yang memerlukan konfirmasi batas deteksi, produsen kit perlu mencakup sebanyak mungkin jenis mikoplasma sebagaimana diharuskan oleh farmakope regulasi dan mengeksplorasi batas deteksi untuk setiap jenis mikoplasma. Untuk perusahaan biofarmasi, disarankan untuk mempertimbangkan jenis mikoplasma manusia juga.
- Jika sel atau bahan unggas digunakan atau ditemukan selama proses produksi, verifikasi batas deteksi untuk Mycoplasma synoviae harus dilakukan.
- Jika bahan serangga atau tanaman digunakan atau ditemukan selama proses produksi, verifikasi batas deteksi untuk Acholeplasma harus dilakukan.
- Mikoplasma hidung babi sangat umum ditemukan dalam sampel yang terkontaminasi mikoplasma dan telah menarik perhatian Institut Pengawasan Obat dan Makanan China.
Dibandingkan dengan Farmakope Eropa, Farmakope Jepang tidak menyebutkan mikoplasma unggas yang memerlukan verifikasi batas deteksi, tetapi mencakup mikoplasma saliva.
Ketahanan:
Ketahanan mengacu pada kemampuan suatu metode untuk menahan variasi kecil dalam kondisi pengukuran tanpa terpengaruh, yang menyediakan dasar bagi penggunaan metode yang ditetapkan dalam pengujian rutin. Evaluasi ketahanan harus difokuskan pada toleransi metode deteksi mikoplasma terhadap variasi konsentrasi MgCl2, primer, dan dNTP dalam reagen deteksi, perubahan kit ekstraksi asam nukleat atau langkah ekstraksi, dan penggunaan penguat asam nukleat yang berbeda.
Studi Perbandingan
Jika NAT akan digunakan sebagai pengganti metode farmakope, perlu dikonfirmasi melalui perbandingan bahwa NAT dapat menggantikan metode berbasis kultur atau metode kultur sel indikator.Hal ini biasanya melibatkan pertimbangan batas deteksi metode, serta spesifisitas (seperti kisaran cakupan mikoplasma dan kemungkinan positif palsu). Untuk membandingkan batas deteksi, kriteria yang harus dipenuhi adalah "batas deteksi 10 CFU/mL dapat menggantikan metode berbasis kultur, dan batas deteksi 100 CFU/mL dapat menggantikan metode kultur sel indikator."
Ada dua pendekatan opsional untuk melakukan studi perbandingan:
- Melakukan percobaan sinkron menggunakan strain mikoplasma tervalidasi yang sama untuk metode NAT dan farmakope guna mengonfirmasi batas deteksi.
- Membandingkan hasil validasi NAT dengan hasil validasi metode farmakope sebelumnya, tetapi diperlukan dokumentasi yang cermat dari file konfirmasi untuk standar mikoplasma yang digunakan dalam kedua metode tersebut.
Deteksi NAT Mycoplasma qPCR - Solusi Komprehensif
Produk Terkait
Layanan Teknis
- Menyediakan laporan validasi komprehensif untuk MycAway™ Mycoplasma qPCR Test Kit.
- Menyediakan layanan teknis untuk validasi penerapan sampel klien.
- Memberikan dukungan audit.
| Keterangan | Nomor Bagian |
| 18461ES | |
| Kit Deteksi qPCR MycAway™ Mycoplasma (2G) | 40619ES |