Cari amici, vi sentite persi quando vi trovate di fronte a vari anticorpi di controllo del caricamento e di marcatura degli epitopi durante l'immunoblotting proteico? Controllo del caricamento le proteine sono codificate da geni housekeeping negli organismi e sono espresse stabilmente in più tessuti. Sono utilizzate per verificare se gli esperimenti immunologici procedono normalmente e come standard di rilevamento semi-quantitativo per l'espressione proteica. Quindi, come si scelgono correttamente gli anticorpi di controllo del caricamento? È possibile fare riferimento ai seguenti punti.

I. Origine delle specie campione

Per campioni di tessuti o cellule di mammiferi, in genere si scelgono β-actina, α-tubulina, GAPDH, Lamin-B, Istone H3, Na+/K+-ATPasi.
Per i campioni derivati da piante, in genere si scelgono actina vegetale, Rubisco, ecc.
Per altri campioni meno studiati, scegliere la proteina appropriata come riferimento interno consultando la letteratura o i database pertinenti.

II. Peso molecolare della proteina bersaglio

Assicurarsi che il peso molecolare della proteina target differisca da quello del controllo di caricamento di oltre 5KDa per prevenire interferenze durante il rilevamento. Ad esempio, se la proteina target è 40KDa, non è opportuno scegliere β-actina (42KDa) come controllo di caricamento. Si consideri di utilizzare GAPDH (36KDa) o β-tubulina (55KDa) come controllo di caricamento.

III. Sito di espressione della proteina di riferimento interna

Pertanto, la scelta del controllo del caricamento la proteina varia a seconda del sito di estrazione della proteina. Ad esempio, quando si estraggono separatamente proteine citoplasmatiche e nucleari anziché proteine totali, scegliere il controllo di caricamento proteine espresse nel sito corrispondente. Ad esempio, H3 è espresso in modo elevato e stabile nel nucleo cellulare e teoricamente non espresso nel citoplasma. Quindi, per l'estrazione delle proteine citoplasmatiche, H3 non dovrebbe essere utilizzato come proteina di riferimento interna. Invece, scegli β-actina, GAPDH, α-tubulina, ecc., che sono espresse nel citoplasma come proteine di riferimento interne.

Nota: evitare le seguenti situazioni quando si utilizza caricamento di anticorpi di controllo

Localizzazione subcellulare	Proteina di controllo del caricamento	Peso molecolare (KDa)	Appunti
Citoplasma, cellula intera	β-actina	42	Non adatto per estratti nucleari. La β-actina è un componente dei complessi di rimodellamento della cromatina; potrebbe non essere adatto a situazioni in cui vi siano differenze di età significative tra i soggetti della ricerca.
	α-tubulina	55	Non adatto per situazioni in cui ci sono differenze di età significative tra i soggetti della ricerca. L'espressione della tubulina cambia con farmaci antimicrobici e antimitotici, quindi non è adatto quando si aggiungono farmaci antitumorali e antimicotici.
	β-tubulina	55
	GAPDH	36	L'ipossia cellulare causerà un aumento dell'espressione di GAPDH, quindi non è adatta per studi correlati all'ossigeno. Fattori come il diabete possono portare a un aumento dell'espressione di GAPDH.
	Vinculina	117	Può essere utilizzato per proteine ad alto peso molecolare.
Mitocondri	Serie COXIV	15-17	Questa serie di proteine è concentrata principalmente a 15-17 KDa. Se il peso molecolare della proteina bersaglio è vicino, prendere in considerazione altri anticorpi di controllo del caricamento.
Mitocondri	HSP60	60
Nucleo	Tipo di prodotto	31-37	Questa serie di proteine è concentrata principalmente a 31-37 KDa.
	Lamina B1	66	Non adatto per cellule staminali embrionali, non adatto come controllo di caricamento negli esperimenti sull'apoptosi.
	PCNA	36	Non adatto alle cellule non proliferanti.
	TBP	33-43	Il TBP è pari a 37-43 KDa negli esseri umani e a 33-36 KDa nei topi e nei ratti, non adatto per esperimenti sull'apoptosi.
	AA1	65-70
	Istone H3	17	La maggior parte delle proteine ha un peso molecolare di circa 17KDa. Se il peso molecolare della proteina bersaglio è vicino, prendere in considerazione altri anticorpi di controllo loadong.
Sangue intero, siero, plasma	Transferrina	77	L'espressione è influenzata da determinati stati patologici e trattamenti, come l'acido retinoico.
Sangue intero, siero, plasma	Albumina	66	Il contenuto è estremamente elevato, prestare attenzione a ridurre il caricamento del campione negli esperimenti WB.

Gli anticorpi di marcatura funzionano meglio se usati insieme

Negli esperimenti che studiano le interazioni proteiche, come il pull-down, i tag epitopici possono essere fusi al terminale N o C della proteina bersaglio tramite metodi di biologia molecolare. I tag epitopici comunemente utilizzati includono His, HA, Myc e GST. Questi tag epitopici solitamente non influenzano l'attività biologica e la localizzazione intracellulare della proteina bersaglio. L'emergere dei tag epitopici ha fornito praticità per la ricerca scientifica e la produzione industriale.

Tag epitopo	Sequenza di tag	Peso molecolare (KDa)
Etichetta HA	YPYDVPDYA	1.1
Etichetta Myc	EQKLISEEDL	1.2
Etichetta bandiera	DYKDDDDK	1
Etichetta GST	-	26
Etichetta GFP	-	26.9
Etichetta V5	GKPIPNPLLGLDST	1.4
Cervo	GIOCO D'AZZARDO	1.8
Etichetta elettronica	GAPVPYPDPLEPR	1.4

Informazioni sul prodotto

Tipo	Nome del prodotto	Peso molecolare (KDa)	Numero di prodotto
Controllo del caricamento dell'anticorpo	β-actina, mAb di topo	42	30101ES
	β-actina, coniglio pAb	42	30102ES
	GAPDH (clone:1A6), anticorpo monoclonale del topo	36	30201ES
	GAPDH, coniglio pAb	36	30202ES
	α-tubulina, mAb di topo	50-55	30304ES
	β-tubulina, mAb di topo	50-55	30301ES
	β-tubulina, coniglio pAb	50-55	30302ES

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Gli anticorpi di marcatura funzionano meglio se usati insieme

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