1 Il principio di azione della geneticomicina

La genetomicina (Geneticin, G418) è un antibiotico aminoglicosidico che inibisce la sintesi proteica bloccando l'estensione della catena peptidica legandosi ai ribosomi 70S e 80S nelle cellule procariotiche ed eucariotiche. Questo meccanismo è tossico per coloro che includono batteri, lieviti, piante e cellule di mammiferi. Quando le cellule sono state trasfettate con successo e integrate con un gene di resistenza alla neomicina (come il gene neo), l'aminoglicoside fosfotransferasi (APH (3) II) codificata dal gene potrebbe modificare covalentemente G418 per inattivarlo, conferendo così resistenza alle cellule cresciute in un mezzo selettivo contenente G418.

Nei test di genetica molecolare, G418 è uno dei geni più comunemente utilizzati per la trasfezione stabile.

2 L'applicazione della geneomicina

2.1 Screening di linee cellulari transfettate stabili

• G418 è stato utilizzato per lo screening di cellule contenenti geni di resistenza (ad esempio, geni neo) inibendo la sintesi proteica. L'aminoglicoside fosfotransferasi codificata dal gene di resistenza inattiva G418, che conferisce resistenza cellulare a G418. In genere, l'intervallo di screening delle cellule di mammifero è 200 - 2000 μg/mL, con la concentrazione di lavoro più comunemente utilizzata di 100 - 700 μg / mL. Laddove le cellule vegetali sono 10-100 μg/mL e le cellule di lievito sono 500-1000 μg / mL, le seguenti sono le concentrazioni utilizzate per alcuni tipi di cellule utilizzando G418 come riferimento.

Cella	Applicazione	Concentrazione di attivazione della geneomicina (μg/mL)	Opere citate
Specie di Mucor	a) Coltivato in terreno di coltura b) Coltivato su batteri liofilizzati	a) 10 μg/mL 30 μg/mL	Hirth, et al., Proc. Accademico Nazionale Sci., v. 79, 7356-7360 (1982).
Mammifero	a) Per lo screening b) Per mantenere la crescita	a) 400 -1000 μg/mL 200 μg/mL	Canaani e Berg, Proc. Accademico Nazionale Sci., v. 79, 5166-5170 (1982).
Pianta	a) Per lo screening b) Per mantenere la crescita	a) 25-50 μg/mL 10 μg/mL	Ursico, et al., Commissione di ricerca biochimica e biofisica, v. 101:3, 1031-1037 (1981).
Lievito	a) Per lo screening b) Per mantenere la crescita	a) 500 μg/mL 125-200 μg/mL	Jimenez e Davies, Natura, v. 287, 869-871 (1980).
Batteri	Per lo screening	16 μg/ml	Waitz, e altri, Agenti antimicrobici Chemoter., v. 6:5, 579-581 (1974).

2.2 Knockout genico e trasferimento genico

• Nel gene knockout, G418 può essere utilizzato per selezionare le cellule che eliminano con successo il gene bersaglio. Nel trasferimento genico, G418 facilita l'integrazione di geni estranei nel genoma delle cellule ospiti.

2.3 Selezione della resistenza nella coltura cellulare

• Durante la coltura cellulare, G418 viene utilizzato per individuare le cellule resistenti all'antibiotico, che spesso sono portatrici di geni di resistenza specifici.

3 Procedure sperimentali rilevanti per la geneomicina

3.1 Preparazione della soluzione madre G418 (50 mg/mL, concentrazione attiva)

1) Conversione delle unità di attività

Convertire utilizzando la formula: (1000/A0) × A1 = A2, dove A0 è la potenza di G418, che varia a seconda del lotto. Fare riferimento al rapporto di controllo qualità per il lotto corrispondente o all'etichetta sulla bottiglia. A1 è la concentrazione attiva desiderata di G418 da preparare. A2 è la concentrazione effettiva polvere-volume da pesare.

Ad esempio, se il lotto di G418 ha una potenza di 750 U/mg e si desidera preparare una concentrazione attiva di 50 mg/mL, la concentrazione effettiva della polvere da preparare è 1000/750 × 50 mg/mL = 66,67 mg/mL.

Se si preparano 10 mL di soluzione madre di G418 (concentrazione attiva, 50 mg/mL), sono necessari 666,7 mg di polvere.

• Sterilizzazione e conservazione

In base al peso effettivo della polvere ottenuto dalla conversione di cui sopra, aggiungerla a 10 ml di acqua deionizzata sterile per scioglierla completamente.

Per prima cosa, pre-inumidire un filtro per siringa da 0,22 μm con 5 mL di acqua deionizzata sterile, rimuovendo tutta l'acqua. Quindi filtrare utilizzando questo filtro per sterilizzare e aliquotare in piccoli volumi per uso singolo (ad esempio, 1 mL) e conservare a -20 °C per una stabilità di 1 anno.

3.2 Stabilimento della curva di uccisione

1) Primo giorno: piastrare le cellule non trasformate al 20-25% di densità cellulare in piastre di coltura appropriate e incubare durante la notte a 37°C, CO₂.

2) Impostare un gradiente di concentrazione entro un intervallo adatto in base al tipo di cellula, selezionando almeno 6 concentrazioni (G418 è più attivo contro le cellule in fase di divisione, quindi le cellule devono essere coltivate per un periodo prima di aggiungere G418), ad esempio, per le cellule di mammifero, impostare 0, 50, 100, 200, 400, 800, 1000 μg/mL.

3) Secondo giorno: rimuovere il vecchio terreno di coltura e sostituirlo con un terreno appena preparato contenente la concentrazione corrispondente del farmaco, con tre repliche per ciascuna concentrazione.

4) Sostituire con nuovo terreno contenente il farmaco ogni 3-4 giorni.

5) Eseguire conteggi di cellule vive a intervalli fissi (ad esempio, ogni 2 giorni) per determinare la concentrazione appropriata che impedisce la crescita di cellule non transfettate. Selezionare la concentrazione più bassa che può uccidere la maggior parte delle cellule entro il numero ideale di giorni (solitamente 7-10 giorni) come concentrazione di lavoro per lo screening di linee cellulari transfettate stabili.

3.3 Screening delle cellule transfettate stabili

• La G418 Geneticin (60220ES) fornita da Yisheng Biotech ha un'efficacia pari a ≥720 U/mg, una purezza di circa il 98% e una stabilità del lotto, con un prezzo pari a quasi un terzo dei prodotti G418 di altre aziende.
• Il terreno di coltura contenente i farmaci veniva sostituito ogni 3-4 giorni.
• La formazione di cloni cellulari (colonie) è stata osservata e valutata dopo 7 giorni di selezione. Le colonie possono impiegare una settimana o più per formarsi, a seconda del tipo di cellula ospite, della trasfezione e dell'efficacia dello screening.
• Sono stati selezionati 5-10 cloni resistenti, trasferiti su piastre di coltura cellulare da 35 mm e ulteriormente conservati con un terreno di coltura contenente il farmaco per 7 giorni.
• Dopo aver cambiato il normale mezzo di coltura.

4 Raccomandazione del prodotto

La genetica G418 (60220ES) fornito da Yeasen Biotech ha un'efficacia pari a ≥720 U/mg, una purezza di circa il 98% e una stabilità del lotto, con un prezzo pari a circa un terzo dei prodotti G418 di altre aziende.

Specificazione	S*	T*	Sììì	Vantaggio Yeasen
Contenuto (HPLC)	/	/	~98%	Elevata purezza
Potenza (U/mg)	≥720 µg/mg	707-721 µg/mg	≥720 µg/mg	Alta efficacia
Prezzo ($/5 g)	~1000	~1000	~200	Economicità

5 Caso sperimentale

In E. coli, G69 e G99 erano due lotti diversi; le concentrazioni di genomicina erano rispettivamente di 8 mg/L, 12 mg/L e 16 mg/L e la concentrazione minima effettiva era di 16 mg/L, che inibiva completamente la crescita di batteri vari.