1 Il principio di azione della geneticomicina

La genetomicina (Geneticin, G418) è un antibiotico aminoglicosidico che inibisce la sintesi proteica bloccando l'estensione della catena peptidica legandosi ai ribosomi 70S e 80S nelle cellule procariotiche ed eucariotiche. Questo meccanismo è tossico per coloro che includono batteri, lieviti, piante e cellule di mammiferi. Quando le cellule sono state trasfettate con successo e integrate con un gene di resistenza alla neomicina (come il gene neo), l'aminoglicoside fosfotransferasi (APH (3) II) codificata dal gene potrebbe modificare covalentemente G418 per inattivarlo, conferendo così resistenza alle cellule cresciute in un mezzo selettivo contenente G418.

Nei test di genetica molecolare, G418 è uno dei geni più comunemente utilizzati per la trasfezione stabile.

2 L'applicazione della geneomicina

2.1 Screening di linee cellulari transfettate stabili

  • G418 è stato utilizzato per lo screening di cellule contenenti geni di resistenza (ad esempio, geni neo) inibendo la sintesi proteica. L'aminoglicoside fosfotransferasi codificata dal gene di resistenza inattiva G418, che conferisce resistenza cellulare a G418. In genere, l'intervallo di screening delle cellule di mammifero è 200 - 2000 μg/mL, con la concentrazione di lavoro più comunemente utilizzata di 100 - 700 μg / mL. Laddove le cellule vegetali sono 10-100 μg/mL e le cellule di lievito sono 500-1000 μg / mL, le seguenti sono le concentrazioni utilizzate per alcuni tipi di cellule utilizzando G418 come riferimento.

Cella

Applicazione

Concentrazione di attivazione della geneomicina (μg/mL)

Opere citate

Specie di Mucor

a) Coltivato in terreno di coltura

b) Coltivato su batteri liofilizzati

a) 10 μg/mL
30 μg/mL

Hirth, et al., Proc. Accademico Nazionale Sci., v. 79, 7356-7360 (1982).

Mammifero

a) Per lo screening

b) Per mantenere la crescita

a) 400 -1000 μg/mL
200 μg/mL

Canaani e Berg, Proc. Accademico Nazionale Sci., v. 79, 5166-5170 (1982).

Pianta

a) Per lo screening

b) Per mantenere la crescita

a) 25-50 μg/mL
10 μg/mL

Ursico, et al., Commissione di ricerca biochimica e biofisica, v. 101:3, 1031-1037 (1981).

Lievito

a) Per lo screening

b) Per mantenere la crescita

a) 500 μg/mL

125-200 μg/mL

Jimenez e Davies, Natura, v. 287, 869-871 (1980).

Batteri

Per lo screening

16 μg/ml

Waitz, e altri, Agenti antimicrobici Chemoter., v. 6:5, 579-581 (1974).

2.2 Knockout genico e trasferimento genico

  • Nel gene knockout, G418 può essere utilizzato per selezionare le cellule che eliminano con successo il gene bersaglio. Nel trasferimento genico, G418 facilita l'integrazione di geni estranei nel genoma delle cellule ospiti.

2.3 Selezione della resistenza nella coltura cellulare

  • Durante la coltura cellulare, G418 viene utilizzato per individuare le cellule resistenti all'antibiotico, che spesso sono portatrici di geni di resistenza specifici.

3 Procedure sperimentali rilevanti per la geneomicina

3.1 Preparazione della soluzione madre G418 (50 mg/mL, concentrazione attiva)

1) Conversione delle unità di attività

Convertire utilizzando la formula: (1000/A0) × A1 = A2, dove A0 è la potenza di G418, che varia a seconda del lotto. Fare riferimento al rapporto di controllo qualità per il lotto corrispondente o all'etichetta sulla bottiglia. A1 è la concentrazione attiva desiderata di G418 da preparare. A2 è la concentrazione effettiva polvere-volume da pesare.

Ad esempio, se il lotto di G418 ha una potenza di 750 U/mg e si desidera preparare una concentrazione attiva di 50 mg/mL, la concentrazione effettiva della polvere da preparare è 1000/750 × 50 mg/mL = 66,67 mg/mL.

Se si preparano 10 mL di soluzione madre di G418 (concentrazione attiva, 50 mg/mL), sono necessari 666,7 mg di polvere.

  • Sterilizzazione e conservazione

In base al peso effettivo della polvere ottenuto dalla conversione di cui sopra, aggiungerla a 10 ml di acqua deionizzata sterile per scioglierla completamente.

Per prima cosa, pre-inumidire un filtro per siringa da 0,22 μm con 5 mL di acqua deionizzata sterile, rimuovendo tutta l'acqua. Quindi filtrare utilizzando questo filtro per sterilizzare e aliquotare in piccoli volumi per uso singolo (ad esempio, 1 mL) e conservare a -20 °C per una stabilità di 1 anno.

3.2 Stabilimento della curva di uccisione

1) Primo giorno: piastrare le cellule non trasformate al 20-25% di densità cellulare in piastre di coltura appropriate e incubare durante la notte a 37°C, CO2.

2) Impostare un gradiente di concentrazione entro un intervallo adatto in base al tipo di cellula, selezionando almeno 6 concentrazioni (G418 è più attivo contro le cellule in fase di divisione, quindi le cellule devono essere coltivate per un periodo prima di aggiungere G418), ad esempio, per le cellule di mammifero, impostare 0, 50, 100, 200, 400, 800, 1000 μg/mL.

3) Secondo giorno: rimuovere il vecchio terreno di coltura e sostituirlo con un terreno appena preparato contenente la concentrazione corrispondente del farmaco, con tre repliche per ciascuna concentrazione.

4) Sostituire con nuovo terreno contenente il farmaco ogni 3-4 giorni.

5) Eseguire conteggi di cellule vive a intervalli fissi (ad esempio, ogni 2 giorni) per determinare la concentrazione appropriata che impedisce la crescita di cellule non transfettate. Selezionare la concentrazione più bassa che può uccidere la maggior parte delle cellule entro il numero ideale di giorni (solitamente 7-10 giorni) come concentrazione di lavoro per lo screening di linee cellulari transfettate stabili.

3.3 Screening delle cellule transfettate stabili

  • La G418 Geneticin (60220ES) fornita da Yisheng Biotech ha un'efficacia pari a ≥720 U/mg, una purezza di circa il 98% e una stabilità del lotto, con un prezzo pari a quasi un terzo dei prodotti G418 di altre aziende.
  • Il terreno di coltura contenente i farmaci veniva sostituito ogni 3-4 giorni.
  • La formazione di cloni cellulari (colonie) è stata osservata e valutata dopo 7 giorni di selezione. Le colonie possono impiegare una settimana o più per formarsi, a seconda del tipo di cellula ospite, della trasfezione e dell'efficacia dello screening.
  • Sono stati selezionati 5-10 cloni resistenti, trasferiti su piastre di coltura cellulare da 35 mm e ulteriormente conservati con un terreno di coltura contenente il farmaco per 7 giorni.
  • Dopo aver cambiato il normale mezzo di coltura.

4 Raccomandazione del prodotto

La genetica G418 (60220ES) fornito da Yeasen Biotech ha un'efficacia pari a ≥720 U/mg, una purezza di circa il 98% e una stabilità del lotto, con un prezzo pari a circa un terzo dei prodotti G418 di altre aziende.

Specificazione

S*

T*

Sììì

Vantaggio Yeasen

Contenuto (HPLC)

/

/

~98%

Elevata purezza

Potenza (U/mg)

≥720 µg/mg

707-721 µg/mg

≥720 µg/mg

Alta efficacia

Prezzo ($/5 g)

~1000

~1000

~200

Economicità

5 Caso sperimentale

In E. coli, G69 e G99 erano due lotti diversi; le concentrazioni di genomicina erano rispettivamente di 8 mg/L, 12 mg/L e 16 mg/L e la concentrazione minima effettiva era di 16 mg/L, che inibiva completamente la crescita di batteri vari.

Figura 1 Test di stabilità e convalida delle concentrazioni efficaci di genomicina tra diversi lotti

6 Precauzioni

  • G418 non deve essere utilizzato insieme ad altri antibiotici/agenti antimicotici (ad esempio, penicillina/streptomicina) perché sono inibitori competitivi di G418. Anche altri antibiotici possono produrre attività crociata.
  • Durante la preparazione della soluzione G418, questa deve essere convertita in base al diverso valore di vitalità (potenza) del lotto G418, in modo da ottenere il liquido di stoccaggio e il liquido di lavoro che richiedono una concentrazione attiva.
  • È possibile che le cellule non transfettate integrate con G418 nel sistema di coltura non vengano uccise perché la concentrazione del farmaco è troppo bassa o troppo densa. In alternativa, le cellule in rapida divisione hanno maggiori probabilità di essere uccise rispetto alle cellule in lenta proliferazione. Le cellule di controllo (non transfettate) potrebbero non essere uccise dopo 5-7 giorni dall'aggiunta di antibiotico e i cloni di cellule transfettate (clononi resistenti) richiedono 10-14 giorni per formarsi.
  • Anche con la dose letale di G418, le cellule possono continuare a dividersi 2-3 volte. L'efficacia di G418 di solito diventa evidente dopo 2 giorni.

7 Articoli pubblicati con i nostri reagenti

[1] Liu S, Zhang X, Yao X, Wang G, Huang S, Chen P, Tang M, Cai J, Wu Z, Zhang Y, Xu R, Liu K, He K, Wang Y, Jiang L, Wang QA, Rui L, Liu J, Liu Y. L'IRE1α dei mammiferi si fonde dinamicamente e funzionalmente con i granuli di stress. Nat Cell Biol. 2024 giugno;26(6):917-931. doi: 10.1038/s41556-024-01418-7. (SE:21.3)

[2] Tan K, Mo J, Li M, Dong Y, Han Y, Sun X, Ma Y, Zhu K, Wu W, Lu L, Liu J, Zhao K, Zhang L, Tang Y, Lv Z. Il ciclo di feedback positivo SMAD9-MYCN rappresenta una dipendenza unica per il neuroblastoma amplificato da MYCN. J Exp Clin Cancer Res. 2022 20 dicembre;41(1):352. doi: 10.1186/s13046-022-02563-3.(SE:11.3)

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Nome del prodotto

Gatto#

Specificazione

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60201ES05/25/60

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60203ES10/60

10/100g

Doxiciclina iclato

60204ES03/08/25

1/5/25g

Cloramfenicolo, grado USP

60205ES08/25/60

5/25/100g

Solfato di kanamicina

60206ES10/60

10/100g

Tetraciclina HCl Tetraciclina cloridrato (USP)

60212ES25/60

25/100g

Vancomicina cloridrato

60213ES60/80/90

100 mg/1 g/5 g

Sale di solfato di gentamicina

60214ES03/08/25

1/5/25g

Cloridrato di spectinomicina

60215ES08

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Fleomicina (20 mg/mL in soluzione)

60217ES20/60

20/5×20mg

Blasticidina S (Blasticidina)

60218ES10/60

10/10×10mg

Nistatina

60219ES08

5g

Solfato G418 (Geneticina)

60220ES03/08

1/5g

Puromicina (soluzione 10 mg/mL)

60209ES10/50/60/76

1×1 /5 ×1 / 1 0 ×1 /50 ×1 mL

Puromicina diidrocloruro

60210ES25/60/72/76/80

25/100/250/500 mg / 1 g

Igromicina B (50 mg/mL)

60224ES03

1 g (20 ml)/10×1 g (20 ml)

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60225ES03/10

1/10g

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60228ES08/25

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Indagine