1. Cosa sono le cellule dendritiche (DC)?
Le cellule dendritiche (DC) sono le cellule presentanti l'antigene (APC) più efficaci nel corpo umano. Le DC sono le uniche APC in grado di stimolare in modo robusto la proliferazione delle cellule T naive. Altri tipi di APC (come monociti, macrofagi, cellule B, ecc.) possono stimolare solo cellule T attivate o di memoria. Pertanto, le cellule DC sono gli iniziatori delle risposte immunitarie delle cellule T adattive e svolgono un ruolo estremamente importante nell'immunità tumorale. Le cellule DC esprimono altamente le molecole MHC-I e MHC-II sulla loro superficie e hanno marcatori di superficie specifici. Assorbono, elaborano e stimolano le cellule T per attivare gli antigeni e, in ultima analisi, determinano la direzione di differenziazione delle cellule T.
2. Fonte di DC
Le cellule DC sono presenti in quantità molto piccole nel corpo. Ci vuole molto tempo per isolare direttamente le DC dal corpo e la resa cellulare è molto bassa, il che limita notevolmente la ricerca e l'applicazione delle DC. Tuttavia, le DC possono essere differenziate e indotte dalle cellule precursori delle DC in diversi tessuti, come le cellule precursori nel fluido del midollo osseo, i monociti nel sangue periferico e il sangue del cordone ombelicale.
Per gli esseri umani, poiché il sangue periferico umano è il più comodo da ottenere e ha il maggior numero di monociti, il metodo più comunemente utilizzato è quello di indurre DC da cellule mononucleari del sangue periferico umano (PBMC). Per i topi, il metodo più comune è quello di indurre DC da cellule del midollo osseo, vale a dire cellule dendritiche derivate dal midollo osseo (BMDC).
Figura 1. Diagramma schematico del metodo classico di preparazione del BMDC
3. Metodo di preparazione del BMDC
I metodi più comuni per preparare i BMDC di topo sono:
3.1 Metodo di coltura BMDC classico - Metodo Inaba (modificato)
3.2 Preparazione su larga scala di BMDC - Metodo Sons
3.3 Preparazione su larga scala di BMDC - metodo Lutz
3.1 [Metodo di coltura BMDC classico] - Metodo Inaba (migliorato)
【Sfondo】
UN. Il numero di BMDC ottenuti con il metodo Inaba è 5-7 x 106/topo;
B. Il metodo originale Inaba utilizza solo GM-CSF per indurre la produzione di BMDC. Sebbene i BMDC ottenuti abbiano una forte capacità stimolante nella reazione dei linfociti misti, la maturità delle DC non è buona quanto quella dell'induzione combinata di GM-CSF+IL-4. Pertanto, il successivo metodo migliorato utilizza spesso l'induzione combinata di GM-CSF+IL-4.
【Fasi di coltivazione】
3.1.1 Ottenere cellule di midollo osseo di topo
1) I topi (di età compresa tra 6 e 10 settimane) sono stati uccisi tramite lussazione cervicale, tutti i femori e le tibie sono stati rimossi chirurgicamente e il tessuto muscolare attorno alle ossa è stato rimosso il più possibile con forbici e pinze.
[Nota] Non danneggiare le ossa.
2) Spostare l'osso sul banco di lavoro pulito e immergerlo in una capsula di coltura sterile contenente alcol al 70% per 2-5 minuti per disinfettarlo e sterilizzarlo, quindi lavarlo due volte con PBS sterile.
3) Spostare l'osso in un'altra nuova piastra di coltura contenente PBS, tagliare le due estremità dell'osso con le forbici e quindi utilizzare una siringa per estrarre il PBS. Inserire l'ago nella cavità del midollo osseo da entrambe le estremità dell'osso e lavare ripetutamente il midollo osseo nella piastra di coltura finché l'osso non diventa completamente bianco.
4) Raccogliere la sospensione di midollo osseo e filtrare i piccoli frammenti e il tessuto muscolare con una rete di nylon da 200 maglie.
5) Centrifugare il filtrato a 1200 giri al minuto per 5 minuti e scartare il surnatante.
6) Aggiungere 2 ml di tampone di lisi dei globuli rossi con cloruro di ammonio (1x), risospendere le cellule e incubare a temperatura ambiente per 3-5 minuti, fino a 10 minimo
7) Aggiungere 10 ml di PBS per neutralizzare l'effetto del tampone di lisi, quindi centrifugare a 1200 giri/min per 5 minuti e scartare il surnatante.
8) Lavare una volta con PBS, quindi risospendere le cellule nel terreno di coltura RPMI1640 contenente il 10% di FBS. Sono state ottenute cellule di midollo osseo di topo.
Preparazione della soluzione di lisi dei globuli rossi con cloruro di ammonio:
UN. Preparare la soluzione di conservazione 10x come segue: pesare 82,9 g NH4Cl, 10,0 g KHCO33 e 0,37 g di Na2EDTA, sciogliere in 1L di acqua distillata, filtrare con 0,22 membrana filtrante da µm da sterilizzare e conservare a 4℃ per 6 mesi;
B. Prima dell'uso, diluire la soluzione di conservazione 10x con acqua distillata sterile in rapporto 1:9 fino a ottenere una soluzione di lavoro 1x.
[Nota] Poiché la soluzione di lisi dei globuli rossi con cloruro di ammonio ha un certo effetto dannoso sulle cellule del midollo osseo, il tempo di emolisi dovrebbe essere ridotto il più possibile.
3.1.2 Induzione della differenziazione delle BMDC
1) Contare le cellule del midollo osseo del topo ottenute nel passaggio 1 e regolare la concentrazione cellulare a 0,5-1× 106/ml con terreno di coltura completo RPMI 1640 contenente il 10% di FBS.
2) Piastrare in una piastra di coltura da 24 pozzetti, 1 ml di cellule per pozzetto, aggiungere GM-CSF di topo ricombinante (20 ng/ml) e IL-4 (10 ng/ml), e coltura in un ambiente a 37℃, 5% di CO2 incubatrice. Questo è il 0° giorno di coltura.
【Nota】
UN. In genere, circa 4-5x107 le cellule del midollo osseo possono essere prelevate da un topo, quindi è possibile seminare almeno 40-50 pozzetti di una piastra da 24 pozzetti.
B. Gli intervalli di concentrazione di GM-CSF e IL-4 sono 20-50 ng/ml e 10-40 ng/ml, rispettivamente.
3) Agitare delicatamente la piastra di coltura ogni 2 giorni, quindi sostituire 3/4 del volume con terreno di coltura fresco e reintegrare le citochine.
4) Tra il 5° e l'8° giorno, soffiare delicatamente il terreno di coltura per raccogliere le cellule sospese e quelle debolmente attaccate.
5) Centrifugare a 1200 giri al minuto per 5 minuti e scartare il surnatante.
6) Risospendere le cellule nel terreno di coltura completo RPMI 1640 contenente il 10% di FBS e contarle, quindi regolare la concentrazione cellulare a 1×106/ml e aggiungere GM-CSF di topo ricombinante (20 ng/ml) e IL-4 (10 ng/ml).
7) Distribuire le cellule in piastre di coltura da 100 mm (fino a 10 ml per piastra) o in piastre di coltura da 6 pozzetti (2 ml/pozzetto).
8) Continuare la coltura a 37℃, 5% di CO2 incubatrice per 1-2 giorni.
9) Raccogliere le cellule sospese, che sono i BMDC più maturi.
【Nota】
UN. I passaggi da 2.5 a 2.8 sono passaggi di riplaccatura, il cui scopo è rendere più maturo il BMDC ottenuto nel passaggio 2.4.
B. Entro 3 ore dalla reimpianto, si possono osservare numerose cellule spinose aderenti che migrano dai cluster di cellule dendritiche (DC) e, dopo 1 giorno di coltura, queste cellule aderenti si staccano dal fondo della piastra di coltura e si possono osservare numerose cellule dendritiche tipiche galleggiare nel terreno di coltura.
3.1.3 Maturazione completa del BMDC
[Nota] I BMDC ottenuti nel passaggio 2 non sono DC completamente maturi. Se si desidera ottenere DC completamente maturi, è comunque necessario essere indotti da LPS, CD40L o TNF-a.
1) Centrifugare il BMDC ottenuto nel passaggio 2.4 o 2.9 a 1200 giri al minuto per 5 minuti e scartare il surnatante.
2) Risospendere il precipitato con terreno di coltura completo RPMI contenente GM-CSF di topo ricombinante (20 ng/ml) e IL-4 (10 ng/ml), e regolare la concentrazione cellulare a 1×106/ml dopo il conteggio.
3) Aggiungere alle piastre di coltura da 24 pozzetti e aggiungere induttori di maturazione come TNF-α (250 Unità/ml), LPS (1 μg/mL), o CD40L (1 (μg/mL).
4) Coltura a 37℃, 5% di CO2 incubatrice per 2 giorni.
5) Raccogliere le cellule sospese e quelle che crescono debolmente attaccate alla parete: si tratta delle cellule dendritiche mature.
3.2【Metodo di produzione di massa BMDC】-Metodo figlio
【Sfondo】
UN. Con questo metodo si possono ottenere 30-40×106 DC/topo entro 7 giorni, che è 7-10 volte superiore al metodo classico Inaba. Dopo che DC è centrifugato attraverso un gradiente di metrizamide al 14,5%, la purezza (ad esempio cellule CD11c+/I-Ab+) può raggiungere l'85-95%.
B. La capacità di endocitosi delle cellule DC ottenute con questo metodo è più debole di quella del metodo classico Inaba, ma la quantità di IL-12p70 secreta è simile.
C. Le cellule DC ottenute con questo metodo hanno una maggiore capacità di stimolazione nella reazione linfocitaria mista rispetto al metodo classico Inaba.
D. Le cellule DC ottenute con questo metodo possono indurre una risposta specifica più forte delle cellule T.
e. In sintesi, il metodo Son consente di ottenere BMDC sempre più maturi rispetto al metodo classico.
【Fasi di coltivazione】
3.2.1 Ottenere cellule del midollo osseo del topo
Vedere i passaggi corrispondenti nel metodo Inaba (modificato).
3.2.2 Preparazione di grandi quantità di BMDC
1) Contare le cellule del midollo osseo del topo ottenute nel passaggio 1 e regolare la concentrazione cellulare a 2×105/ml con terreno di coltura completo RPMI 1640 contenente il 10% di FBS.
2) Distribuire in piastre di coltura da 6 pozzetti, 5 ml di cellule per pozzetto, aggiungere GM-CSF di topo ricombinante (1000 Unità/ml) e IL-4 (1000 Unità/ml), e coltura in un ambiente a 37℃, 5% di CO2 incubatrice.
3) Il 4° giorno di coltura, integrare il sistema di coltura con GM-CSF di topo ricombinante (1000 Unità/ml) e IL-4 (1000 Unità/ml).
4) Raccogliere le cellule DC il 7° giorno di coltura, risospendere con 2-4 ml RPMI 1640 terreno di coltura completo, aggiungere a un volume uguale di 14,5% (p/v) di mepanema e centrifugare a temperatura ambiente per 20 minimo a 1200xg.
5) Raccogliere lo strato intermedio e lavarlo tre volte con il terreno di coltura completo RPMI 1640 per un uso successivo.
[Nota] Il DC a questo punto è un BMDC immaturo. Se vuoi farlo maturare ulteriormente, vai al passaggio 3.
3.2.3 Piena maturità del BMDC
1) Ripiastrare i BMDC raccolti nel passaggio 2.4 e aggiungere GM-CSF di topo ricombinante (1000 Unità/ml) e IL-4 (1000 Unità/ml), così come LPS (1-10 mg/ml) al sistema culturale
2) Coltivato a 37℃, 5% di CO2 incubatore per 2 giorni per ottenere BMDC maturi.
3.3【Metodo di preparazione della massa BMDC】-Metodo Lutz
【Sfondo】
UN. Il metodo Lutz è simile al metodo Son ed entrambi i metodi possono preparare BMDC in grandi quantità, ma il metodo Lutz è più ampiamente utilizzato del metodo Son.
B. Questo metodo può ottenere più BMDC, fino a 1-3 x 108 DC/mouse e la purezza può raggiungere il 90-95%;
C. La concentrazione di citochine utilizzata in questo metodo è molto più bassa di quella del metodo Son, solo 200 Unità/ml, e scende a 30-100 Unità/ml dall'8° al 10° giorno di coltura, con un notevole risparmio sui costi dei reagenti;
D. La differenza più grande tra questo metodo e il metodo classico Inaba e il metodo Son è che le cellule del midollo osseo vengono coltivate in una capsula di coltura batterica (capsula di Petri) anziché in una piastra di coltura cellulare. Inaba ha spiegato che la capsula di coltura batterica non è facile per i macrofagi nel midollo osseo ad aderire alla parete, inibendo così lo sviluppo dei macrofagi ed evitando l'effetto inibitorio dei macrofagi sulla maturazione delle DC. Questo potrebbe essere il motivo principale per cui questo metodo può ottenere un gran numero di BMDC a una densità di placcatura inferiore.
e. Tuttavia, il tempo di coltura di questo metodo è relativamente lungo, richiedendo 10-12 giorni. Da un lato, questo serve per ottenere più BMDC. Dall'altro, la maggior parte dei granulociti e dei linfociti difficilmente sopravvive per così tanto tempo, quindi la purezza dei BMDC infine ottenuti può essere migliorata;
F. Questo metodo utilizza solo GM-CSF per la coltura di induzione e le BMDC ottenute contengono sia DC immature che mature. Per migliorare ulteriormente la maturità, è necessario utilizzare LPS o TNF-α per altri 1-2 giorni di induzione e il contenuto di cellule DC mature raggiungerà il 50-70%.
【Fasi di coltivazione】
3.3.1 Ottenere cellule del midollo osseo del topo
Vedere i passaggi corrispondenti nel metodo Inaba (modificato) e notare che il passaggio dell'emolisi deve essere omesso.
3.3.2 Preparazione su larga scala di BMDC
1) Contare le cellule del midollo osseo del topo ottenute nel passaggio 1 e regolare la concentrazione cellulare a 2×105/ml con terreno di coltura completo RPMI 1640 contenente il 10% di FBS;
2) Distribuire in piastre di coltura batterica da 100 mm (piastra Petri), 10 ml di cellule per piastra, e aggiungere GM-CSF di topo ricombinante (200 Unità/ml), e coltura a 37℃, incubatore al 5% di CO2;
[Nota] In questo caso vengono utilizzate piastre per colture batteriche e non piastre per colture cellulari.
3) Il 3° giorno aggiungere 10 ml di terreno di coltura completo contenente 20 ng/ml GM-CSF di topo ricombinante nella capsula di coltura;
4) Il 6° e l'8° giorno, sostituire metà del terreno di coltura, ovvero raccogliere il vecchio terreno di coltura, risospendere il pellet cellulare con terreno di coltura completo contenente 20 ng/ml GM-CSF di topo ricombinante dopo la centrifugazione, quindi rimettere la sospensione cellulare nella capsula originale;
5) Il decimo giorno si possono raccogliere le cellule, che sono BMDC.
3.3.3 Maturazione completa dei BMDC
1) Raccogliere le cellule sospese soffiando delicatamente sulle DC il 10° giorno di coltura con una pipetta e centrifugare a 300xg per 5 minuti a temperatura ambiente;
2) Scartare il surnatante, risospendere il pellet cellulare con 10 ml di terreno di coltura completo RPMI 1640 e quindi distribuirlo su una piastra di coltura cellulare da 100 mm;
3) Aggiungere GM-CSF di topo ricombinante (100 Unità/ml) e TNF-α (500 Unità/ml), o GM-CSF di topo ricombinante (100 Unità/ml) e LPS (1 (mg/ml);
4) Continuare la coltura a 37℃, 5% di CO2 incubatrice per 1-2 giorni.
4. Identificazione dei BMDC
l Osservazione morfologica: la maggior parte dei BMDC cresce in colonie e le cellule presentano molteplici protrusioni dendritiche, più evidenti nei BMDC maturi.
l Analisi del fenotipo cellulare: è stata utilizzata la citometria a flusso per rilevare l'espressione di CD11c, CD40, CD80, CD86, molecole MHC di classe II (IA/IE) sulla superficie delle cellule DC. Le BMDC esprimono ampiamente queste molecole e l'espressione di queste molecole nelle BMDC completamente mature sarà ulteriormente aumentata.
l Reazione linfocitaria mista (MLR): i BMDC hanno una forte capacità stimolatoria e maggiore è la maturità, maggiore è la capacità stimolatoria.
5. Come scegliere un induttore di maturazione?
LPS, CD40L e TNF-α sono induttori di maturazione comunemente usati ed efficaci sia per le DC umane che per le DC di topo. Il TNF-α ha la capacità più debole di indurre la maturazione delle DC tra i tre. LPS e CD40L sono entrambi forti induttori per la piena maturazione delle DC in vitro. La maturazione delle DC indotta da entrambi è simile, ma lo spettro di citochine indotte è diverso. Le BMDC mature indotte da CD40L mostrano la più forte capacità immunoregolatrice in vivo, inclusa la generazione di risposte immunitarie tumorali protettive e terapeutiche. La concentrazione utilizzata per stimolare la piena maturazione delle DC con LPS è generalmente 1-10 μg/mL, ma in realtà 0,1 μg/mL ha un effetto molto forte, ma per scopi assicurativi, 1 μg/mL è generalmente utilizzato. Va notato che le molecole CD40L appartengono alla famiglia dei ligandi TNF, che è caratterizzata dal fatto che possono funzionare solo dopo aver formato trimeri. Pertanto, è meglio utilizzare la proteina trimera CD40L ricombinante per stimolare DC, il che avrà un buon effetto. Se vengono utilizzati monomeri CD40L per stimolare DC, la maturità non è molto elevata nella maggior parte dei casi.
6. Scelta del metodo di allenamento
Tabella 1.Confronto di tre metodi sperimentali comuni per la preparazione del BMDC
| Parametro | Metodo di coltura BMDC classico - Metodo Inaba | Preparazione su larga scala di BMDC - Metodo Son | Preparazione su larga scala di BMDC - metodo Lutz |
| Numero di citazioni in PubMed | 783 | 24 | 663 |
| Emolisi del midollo osseo, lisi dei globuli rossi | SÌ | SÌ | NO |
| Il midollo osseo rimuove prima i linfociti | SÌ | NO | NO |
| Rimozione dei granulociti durante la coltura | SÌ | NO | NO |
| Volume iniziale di placcatura delle cellule del midollo osseo | 1 ml | 15ml | 10ml |
| Incubatrice | Piastre per coltura cellulare a 24 pozzetti | Piastra per coltura cellulare a 6 pozzetti | Piatto per coltura batterica da 100 mm |
| Terreno di coltura | RPMI 1640+10% FCS | ||
| Concentrazione di GM-CSF di topo | 200-1000 Unità/ml | La concentrazione iniziale aggiunta è 125-1000 Unità/ml Il 4° e il 7° giorno vengono aggiunte al sistema di coltura quantità sufficienti di GM-CSF e IL-4. | La concentrazione iniziale aggiunta è 200 Unità/ml.3-100 Unità/ml dopo il 10° giorno |
| IL-4 del topo | Non è necessario | Bisogno,La concentrazione è la stessa del GM-CSF | Non è necessario |
| Metodo di scambio dei fluidi | Il 2° e il 4° giorno, scartare il 50%-75% del vecchio terreno di coltura (contenente cellule) e sostituirlo con un terreno di coltura completo e fresco contenente una quantità sufficiente di GM-CSF. | / | Il 3° giorno è stato aggiunto un volume uguale di terreno di coltura completo contenente GM-CSF. Il 6°, 8° e 10° giorno è stata sostituita metà del terreno. Il vecchio terreno di coltura (contenente cellule) è stato aspirato, centrifugato, risospeso in terreno di coltura completo fresco contenente GM-CSF e quindi rimesso. |
| Tempo di coltura prima del passaggio (espansione) | 6 giorni | 7 giorni | 10 giorni |
| Tempo di coltura dopo il passaggio (maturazione) | 2 giorni | Nessuno | 1-2 giorni |
| Induttore di piena maturità | TNF-α(250 Unità/ml） | LPS(1-10 (mg/ml) | TNF-α(250 Unità/ml）o LPS(1 (mg/ml) |
| Tempo di raccolta delle celle DC | 7-8 giorni | 7-8 giorni | 10-13 giorni |
| Purezza DC | Giorno 8：60-70% | Giorno 7：85-95% | Giorno 10-12：80-90% |
| Produzione DC/mouse | (5-7)×106 | (3-4)×107 | (1-3)×108 |
7. Reagenti di coltura DC consigliati
| Nome del prodotto | Gatto | Misurare |
| 91108È | 5 mg/50 mg/100 mg/500 microgrammi | |
| 90144ES | 5 mg/50 mg/100 mg/500 microgrammi | |
| 90621ES | 5 mg/20 mg/50 mg/500 microgrammi | |
| 94016ES | 25 mg/100 mg/500 microgrammi |