Mitocondri
I mitocondri sono le fabbriche di energia della cellula, il sito principale della fosforilazione ossidativa intracellulare e della sintesi di adenosina trifosfato (ATP), che fornisce energia per le attività cellulari. Il 95% dell'energia richiesta per le attività vitali cellulari proviene dai mitocondri. Oltre a fornire energia alle cellule, i mitocondri sono anche coinvolti in processi come la differenziazione cellulare, il trasferimento di informazioni cellulari e l'apoptosi e possiedono la capacità di regolare la crescita cellulare e il ciclo cellulare. Pertanto, analisi come i mitocondri e le membrane mitocondriali sono una parte essenziale dello studio delle cellule.
Definizione e importanza del potenziale della membrana mitocondriale
Il potenziale di membrana mitocondriale è il risultato della distribuzione della carica su entrambi i lati della membrana mitocondriale interna ed è un fattore chiave per il mantenimento della normale funzione mitocondriale. Nei mitocondri, la catena di trasporto degli elettroni genera un gradiente protonico attraverso reazioni redox che guidano la sintesi di ATP. La stabilità del potenziale di membrana mitocondriale è direttamente correlata all'apporto energetico della cellula e al suo stato di sopravvivenza. Un gran numero di studi ha dimostrato che i mitocondri sono strettamente correlati all'apoptosi, in cui la diminuzione del potenziale transmembrana mitocondriale è considerata uno dei primi eventi nel processo di reazione a cascata apoptotica. Si verifica prima della comparsa di caratteristiche apoptotiche (condensazione della cromatina, rotture del DNA) nel nucleo e una volta che il potenziale transmembrana mitocondriale collassa, l'apoptosi è irreversibile. Pertanto, la diminuzione del potenziale di membrana mitocondriale è un evento distintivo nelle fasi iniziali dell'apoptosi.
Principio di funzionamento della sonda JC-1
JC-1 è un colorante fluorescente lipidico cationico, che può essere utilizzato come indicatore del potenziale transmembrana mitocondriale. JC-1 esiste in due stati: monomero e multimero. A bassa concentrazione, esiste come monomero e può essere rilevata una fluorescenza verde; quando viene rilevata mediante saggio a flusso continuo, solitamente si trova nel canale FL-1 (lo stesso canale del FITC). Ad alta concentrazione, esiste come multimero e può essere rilevata la luce rossa, e quando viene rilevato mediante saggio a flusso continuo, si trova solitamente nel canale FL-2 (lo stesso canale del PE). JC-1 può anche essere utilizzato come colorante fluorescente lipidico cationico e può essere utilizzato come indicatore del potenziale transmembrana mitocondriale. e PE stesso canale). A causa del cambiamento della concentrazione di JC-1, si forma un processo di transizione reversibile tra monomero e multimero.
Nelle cellule normali, quando il potenziale di membrana è normale, JC-1 entra nei mitocondri attraverso la polarità della membrana mitocondriale e forma multimeri fluorescenti rossi a causa dell'aumento della concentrazione, mentre nelle cellule apoptotiche, il potenziale transmembrana mitocondriale è depolarizzato e JC-1 viene rilasciato dai mitocondri a una concentrazione ridotta e invertito nella forma monomerica fluorescente verde. Pertanto, i cambiamenti nel potenziale di membrana mitocondriale possono essere rilevati rilevando la fluorescenza verde e rossa.
Nota: Immagini citate da Internet
Sonda JC-10
JC-10, un derivato di JC-1, è una sonda dipendente dal potenziale utilizzata per determinare il potenziale transmembrana mitocondriale mediante citometria a flusso, microscopia a fluorescenza e saggi di fluorescenza basati su piastre di microtitolazione. Nelle cellule sane, JC-10 si accumula selettivamente nei mitocondri, generando aggregati rossi che presentano un ampio spettro di eccitazione ed emissione di grandi valori a 590 nm.Tuttavia, nelle cellule apoptotiche e necrotiche con basso potenziale transmembrana mitocondriale, JC-10 diffonde fuori dai mitocondri e produce monomeri JC-10, determinando uno spostamento verso l'emissione verde (525 nm). È stato utilizzato con successo come indicatore del potenziale transmembrana mitocondriale in una varietà di tipi di campioni, tra cui miociti, neuroni, tessuti intatti e mitocondri isolati.
JC-10--Sostituzione per JC-1
- Stabilità: JC-10 presenta un minore bias di rilevamento perché ha una maggiore solubilità e una maggiore sensibilità nei mezzi acquosi.
- Segnale migliorato: JC-10 ha un rapporto segnale/fondo più elevato rispetto a JC-1.
- Maggiore sensibilità: JC-10 è in grado di rilevare sottili cambiamenti nella perdita di potenziale transmembrana mitocondriale meglio di JC-1 in tutte le linee cellulari testate.
- Ampia applicazione: JC-10 può essere utilizzato negli epatociti primari di ratto.
- Comodo: JC-10 è compatibile con marcatori enzimatici fluorescenti, imager cellulari e citofluorimetri.
Note:. I cambiamenti del potenziale di membrana mitocondriale indotti dai comedoni sono stati misurati nelle cellule Jurkat con JC-10 e JC-1. Dopo aver trattato le cellule Jurkat con camptotecina (10 mM) per 4 ore, le soluzioni di sovracampionamento del colorante JC-1 e JC-10 sono state aggiunte ai pozzetti e incubate per 30 minuti. L'intensità di fluorescenza delle forme aggregate e monomeriche di JC-1 e JC-10 è stata misurata a Ex/Em = 490/525 nm e 490/590 nm utilizzando un etichettatore enzimatico NOVOstar (BMG Labtech).
Analisi dei risultati
Quando si rileva il monomero JC-1, la luce di eccitazione può essere impostata a 490 nm e la luce di emissione può essere impostata a 530 nm; quando si rileva il polimero JC-1, la luce di eccitazione può essere impostata a 525 nm e la luce di emissione può essere impostata a 590 nm. L'apoptosi è stata rilevata tramite citometria a flusso, la fluorescenza verde è stata rilevata tramite il canale FL-1 e la fluorescenza rossa è stata rilevata tramite il canale FL-2. FL-1+, FL-2+ sono cellule normali, mentre FL-1+, FL-2- sono cellule apoptotiche.
Nota: la fonte dell'immagine è il sito web della China Streamline Association forums
Operare senza dubbio
D: Sonda fluorescente per il potenziale di membrana mitocondriale JC-1: questo prodotto può essere utilizzato per colorare sezioni di tessuto?
A: Digerire il tessuto vivo in singole cellule per garantirne l'attività prima della colorazione.
D: Posso fissare le cellule prima di colorarle con JC-1?
R: No. Il colorante JC-1 si accumula nei mitocondri in modo dipendente dal potenziale e può essere utilizzato per rilevare cellule, tessuti o potenziali di membrana mitocondriali purificati. L'immobilizzazione interrompe il potenziale elettrico, con conseguente incapacità della sonda di accumularsi sui mitocondri e perdita di specificità.
Q: Nella soluzione di lavoro JC-1 sono presenti particelle aggregate e ho intenzione di rimuoverle tramite centrifugazione prima della colorazione. Ci sono parametri consigliati per la centrifugazione?
A: La soluzione di lavoro JC-1 può essere centrifugata a 13.000 g per circa 1-2 minuti.
Informazioni per l'ordinazione
| Nome del prodotto | Articolo n. | Specificazione |
| Sonda fluorescente del potenziale di membrana mitocondriale JC-1 | 40705ES03/08 | 1mg/5mg |
| Sonda fluorescente del potenziale di membrana mitocondriale JC-10 | 40707ES03/08 | 1mg/5mg |