Introduzione all'apoptosi
L'apoptosi è un fenomeno di morte cellulare programmata che si verifica durante lo sviluppo di una cellula o quando è influenzata da determinati fattori, ed è innescata dalla regolazione dei geni intracellulari e dei loro prodotti. Nel percorso dell'apoptosi, gli eventi si verificano in ordine cronologico, uno per uno, portando alla presentazione di vescicole apoptotiche, e quindi si verifica l'apoptosi. L'apoptosi svolge un ruolo cruciale nello sviluppo embrionale e nella morfogenesi, nel mantenimento di una popolazione stabile di cellule normali nei tessuti, nella difesa dell'organismo e nelle risposte immunitarie, nel danno cellulare causato da malattia o intossicazione, nell'invecchiamento e nello sviluppo di tumori, e ha un potenziale valore terapeutico.
Principio di rilevamento
La distribuzione dei fosfolipidi nelle membrane cellulari normali è asimmetrica. La fosfatidilserina (PS) si trova sulla superficie interna della membrana cellulare nelle cellule viventi e, durante l'apoptosi, la membrana cellulare subisce un cambiamento e la PS viene capovolta dalla superficie interna della membrana cellulare alla superficie esterna della membrana cellulare. L'annessina V riconosce specificamente la PS sulla superficie delle cellule apoptotiche, mentre la PS delle cellule viventi si trova sulla superficie interna della membrana cellulare e non è in grado di legarsi specificamente all'annessina V.
Anche il PS delle cellule necrotiche si sposta dalla superficie interna della membrana cellulare alla superficie esterna della membrana cellulare, e anche l'Annessina V riconosce il PS sulla superficie delle cellule necrotiche, quindi l'Annessina V non è in grado di distinguere tra cellule necrotiche e apoptotiche. Al contrario, il colorante PI è stato in grado di legarsi al DNA intracellulare e di distinguere tra cellule necrotiche e cellule viventi. La membrana cellulare delle cellule apoptotiche precoci e delle cellule viventi è ancora intatta, e il colorante PI non può attraversare liberamente la membrana cellulare per entrare nella cellula e legarsi al DNA, quindi il colorante PI non può etichettare le cellule apoptotiche e le cellule viventi, mentre il colorante PI è in grado di attraversare la membrana cellulare delle cellule necrotiche e di legarsi al DNA all'interno della cellula, e il colorante PI nelle cellule necrotiche emetterà fluorescenza rossa dopo essere stato eccitato dal laser a 488 nm, che verrà ricevuto dal canale corrispondente. Quindi l'Annessina V e il PI possono essere utilizzati simultaneamente per distinguere tra cellule viventi, cellule apoptotiche precoci e cellule apoptotiche o necrotiche tardive.
Fig. 2 Principio di rilevamento dell'Annessina V/PI
Rilevazione della citometria a flusso
La lunghezza d'onda di eccitazione massima del FITC è 488 nm, la lunghezza d'onda di emissione massima è 525 nm e la fluorescenza verde del FITC viene rilevata nel canale FL1. La lunghezza d'onda di eccitazione massima del complesso PI-DNA è 535 nm, la lunghezza d'onda di emissione massima è 615 nm e la fluorescenza rossa di PI è rilevata nel canale FL2 o FL3. L'analisi è stata eseguita con un software come CellQuest ed è stato disegnato un diagramma di dispersione a due colori con FITC come coordinata orizzontale e PI come coordinata verticale. In esperimenti tipici, le cellule possono essere divise in tre sottopopolazioni, con cellule vive che hanno solo una fluorescenza di fondo di intensità molto bassa, cellule apoptotiche precoci che hanno solo una forte fluorescenza verde e cellule apoptotiche tardive che hanno una doppia colorazione con fluorescenza verde e rossa.
Fig.3 Rilevazione della citometria a flusso
Domande frequenti
D: Il test dell'apoptosi dell'annessina V può essere applicato alle piante o ai batteri (procarioti)?
R: Sì, ma è necessario preparare i protoplasti perché le cellule vegetali o i batteri (procarioti) contengono pareti cellulari. Il dosaggio specifico della soluzione colorante deve solo immergere le cellule e il tempo di colorazione è leggermente diverso per le diverse cellule.
D: Come giudicare il risultato dell'esperimento?
A: Le cellule vive (Annessina V-/PI-), le cellule ad apoptosi precoce (Annessina V+/PI-), le cellule ad apoptosi tardiva e le cellule necrotiche mostrano doppia positività (Annessina V+/PI+), nuclei nudi (Annessina V-/PI+).
D: Qual è la differenza tra Annexin V e TUNEL?
A: La marcatura TUNEL (Terminal Deoxynucleotidyl Transferase dUTP) è un metodo di colorazione utilizzato per identificare i siti di frammentazione del DNA intracellulare, una caratteristica distintiva dell'apoptosi tardiva.
La colorazione con annessina V riconosce le fasi iniziali dell'apoptosi legandosi ai residui di PS esposti all'esterno della cellula a causa della perdita dell'asimmetria della membrana cellulare.
D: È possibile eseguire il test utilizzando solo l'Annessina V-FITC senza rilevare il PI?
R: Sì, è possibile. Per campioni di test speciali, come globuli rossi senza nuclei, o l'uso del farmaco Doxorubicina (Adriamicina) che interferisce con il rilevamento di PI, è possibile eseguire il test utilizzando solo Annexin V-FITC in entrambi i casi.
Dettagli del prodotto
| Nome del prodotto | Articolo n. | Specificazione |
| Kit di rilevamento dell'apoptosi Annexin V-FITC/7-AAD | 40311ES20/50/60 | 20T/50T/100T |
| 40302ES20/50/60 | 20T/50T/100T | |
| Kit di rilevamento dell'apoptosi Annexin V-PE/7-AAD | 40310ES20/50/60 | 20T/50T/100T |
| 40303ES20/50/60 | 20T/50T/100T | |
| Kit di rilevamento dell'apoptosi Annexin V-YSFluor™ 488/7-AAD | 40313ES60 | 100T |
| 40305ES20/50/60 | 20T/50T/100T | |
| 40304ES20/50/60 | 20T/50T/100T | |
| Kit di rilevamento dell'apoptosi Annexin V-YSFluor™ 647/7-AAD | 40312ES20/50/60 | 20T/50T/100T |
| 40306ES20/50/60 | 20T/50T/100T | |
| 40307ES20/50/60 | 20T/50T/100T | |
| 40308ES20/50/60 | 20T/50T/100T |